오늘은 분자 진단 기술 중 우리에게 잘 알려진 이름인 SHERLOCK이라는 기술의 논문에 대해 리뷰해 보려고 합니다.
논문의 이름은 SHERLOCK: Nucleic acid detection with CRISPR nucleases입니다.
Specific High sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing, 줄여서 SHERLOCK 기술은 유전자 가위 기술을 이용한 핵산 검출 플랫폼입니다.
유전자 가위를 사용하기 전에 crispr RNA (crRNA)가 인식할 수 있는 유전자를 증폭시키는 과정도 포함되어 있기 때문에 보다 높은 민감도와 특이도로 표적 핵산을 검출할 수 있는 기술입니다.
1. SHERLOCK 기술이란?
감염성, 농작물 병원체, 그리고 질병과 관련된 핵산을 검출하는 것은 건강이나 생명공학 응용 분야에 있어서 매우 중요한 기술입니다.
현재 이러한 핵산 검출 기술의 표준으로 사용되는 기술은 polymerase chain reaction (PCR) 기술이며 높은 민감도와 특이도를 가지는 기술이지만 반복적인 온도 조절을 위한 큰 부피의 thermal cycler를 필요로 하기 때문에 휴대가 어려워 현장에서 사용하기가 어렵다는 단점이 있습니다.
PCR 기술의 대체 기술로 thermal cycler를 필요로 하지 않는 등온 증폭 (isothermal amplification) 기술이 활발히 연구되고 있습니다.
과거 등온 핵산 증폭 기술은 일정 온도에서 반응을 진행하는 장점이 있었지만 PCR 기술 대비 반응 효율이 너무 좋지 않았습니다.
하지만 recombinase polymerase amplification (RPA), loop mediated isothermal amplification (LAMP)와 같은 고효율의 등온 핵산 증폭 기술들이 개발되어 활용되고 있습니다.
또한, 유전자 가위 기술인 CRISPR 기술과 등온 핵산 증폭 기술이 함께 사용되고 있습니다.
CRISPR Cas 기술 중 CRISPR Cas12a와 CRISPR Cas13a는 crispr RNA (crRNA)가 핵산을 인식하면 그것들의 특수한 기작을 통해 신호를 증폭시킬 수 있는 기술입니다.
오늘 리뷰할 논문에서는 등온 핵산 증폭 기술 중 하나인 RPA 기술과 CRISPR Cas13a를 함께 사용하였으며 결과적으로 고민감도 그리고 고특이도로 표적 DNA와 RNA를 검출하였습니다.
2. SHERLOCK 기술에 대한 설명
DOI: https://doi.org/10.1038/s41596-019-0210-2.
Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., & Zhang, F. (2019).
SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases.
Nature protocols, 14(10), 2986-3012.
이제 위 모식도를 보고 SHERLOCK 기술이 초기의 핵산으로부터 신호를 내는 과정에 대해 이야기하도록 하겠습니다.
위 그림을 보면 표적 핵산이 이중 가닥의 DNA 일 경우와 RNA일 경우를 나눠서 표현한 것을 알 수 있습니다.
RPA 반응의 경우 DNA를 표적으로 하여 수없이 많은 이중 가닥의 DNA를 만드는 기술로 RNA를 표적으로 인식하려면 reverse transcription (RNA로부터 DNA를 만드는 반응)이 필요하기 때문에 reverse transcription-RPA (RT-RPA)를 진행하는 것입니다.
다음으로, CRISPR Cas13a 시스템은 RNA를 인식하여 collateral cleavage 활성을 보이는 시스템이기 때문에 RPA 반응의 생성물인 이중 가닥의 DNA를 인식할 수 없습니다.
그렇기 때문에, RPA 혹은 RT-RPA 반응이 진행된 다음 T7 transcription 반응을 진행하게 됩니다.
RPA 반응의 결과로 생성된 이중 가닥의 DNA에는 T7 promoter를 포함하는 염기 서열이 있습니다.
T7 promoter 부분에 RNA polymerase가 결합한 후 많은 양의 RNA를 생성하게 됩니다.
생성된 많은 양의 RNA는 CRISPR Cas13a 시스템이 인식하고 주변에 있는 RNA reporter를 절단하게 됩니다.
위 그림에서 collateral cleavage라고 표현한 이러한 활성은 CRISPR Cas13a가 RNA를 인식했을 때 주변에 있는 RNA를 비특이적으로 자르게 됩니다.
RNA reporter의 경우 짧은 RNA를 사용하며 5’ 말단에는 형광 물질을 3’ 말단에는 quencher를 표지하여 사용합니다.
Collateral cleavage에 의해 절단되기 전에는 형광 물질과 quencher가 가까워서 형광이 발생하지 않지만 절단되면 두 물질 사이의 거리가 멀어져 형광이 발생하게 됩니다.
이러한 원리를 통해 SHERLOCK 기술은 DNA나 RNA를 높은 효율로 검출할 수 있습니다.
3. SHERLOCK 기술에 대한 나의 의견
논문에서 SHERLOCK 기술은 RPA 기술 말고도 LAMP, helicase dependent amplification (HDA) 등과 같은 다른 등온 증폭 기술과 함께 사용 가능하다고 이야기하고 있습니다.
저의 생각으로는 위의 기술뿐 아니라 표적 물질이 RNA라면 nucleic acid sequence based amplification (NASBA) 반응이 함께 사용되는 것이 효율이 좋을 것으로 생각합니다.
논문에서 Zika 바이러스를 매우 민감하게 검출한 결과와 기술을 입증하기 위한 젤 분석 등을 토대로 SHERLOCK 기술의 유효성을 입증하였습니다.
SHERLOCK 기술은 PCR 기술과 비교하였을 때 등온에서 반응이 진행되기 때문에 부피가 큰 thermal cycler를 필요로 하지 않아 휴대성이 용이하여 현장 진단에 활용하기 좋으며 민감도와 특이도 또한 매우 훌륭한 기술이지 때문에 PCR 기술을 대체할 수 있는 좋은 기술 중 하나라고 생각합니다.