오늘은 원형의 template로부터 긴 단일 가닥의 DNA를 생성하는 등온 증폭 기술인 rolling circle amplification (RCA)에 대해 알아보겠습니다.
RCA 기술은 프라이머 및 프로브 설계가 간단하다는 장점이 있어 단일 가닥의 DNA나 RNA를 증폭하는데 널리 활용되는 기술입니다.
또한, 일단 프라이머가 원 모양의 DNA에 결합하면 반복/순환적으로 증폭이 되기 때문에 높은 효율성을 보입니다.
1. Rolling circle amplification (RCA) 특징
RCA 기술의 특징에 대해 알아보겠습니다.
1) RCA 기술은 동그란 모양의 DNA template에 프라이머가 결합한 후 원형의 template를 따라 DNA를 계속 합성하는 기술입니다.
2) RCA 기술은 다양한 방식으로 진행이 가능하지만 필자가 생각하기에 많이 사용되는 방식으로는 표적 핵산에 의해 직선의 DNA를 원형의 DNA로 만드는 과정과 생성된 원형의 template에서 긴 단일 가닥의 DNA 만드는 과정으로 구성됩니다.
3) RCA 기술 역시 등온에서 반응이 진행되기 때문에 온도 변환을 위한 큰 기기를 필요로 하지 않아 현장진단 적용에 유리합니다.
4) 긴 단일 가닥의 반응 산물을 통해 비교적 다양한 방식으로 증폭 결과를 확인할 수 있습니다.
예를 들어, molecular beacon이나 SYBR green II (단일 가닥의 DNA에 비특이적으로 결합하는 dye) 그리고 최근에는 유전자 가위를 활용하는 기술 또한 연구되고 있습니다.
2. RCA 원리
이제 기술의 원리를 알아보겠습니다.
기술의 원리 설명은 앞서 언급했듯이 크게 2가지의 파트로 나눠서 설명하려고 합니다.
1. 원 모양의 template를 만드는 과정
1) 표적 핵산(위 그림에서 ligation template)이 circular template에 결합합니다.
Ligation template는 중간에 1base만 circular template에 상보적으로 결합하지 않는 상황입니다.
2) Ligase(연결 효소)의 활성을 이용하여 상보적으로 결합하지 않은 1 base를 연결합니다.
이를 통해 긴 막대기를 둥글게 말아 놓은 모양이었던 circular template가 원형의 DNA가 됩니다.
2. 긴 단일 가닥의 DNA를 만드는 과정
1) 앞선 과정에서 생성된 원형의 DNA에 프라이머가 상보적으로 결합합니다.
2) 위 그림에서 보는 것과 같이 DNA polymerase의 활성으로 긴 단일 가닥의 DNA를 생성하게 됩니다.
Takahashi, H., Ohkawachi, M., Horio, K., Kobori, T., Aki, T., Matsumura, Y., … & Okamura, Y. (2018).
RNase H-assisted RNA-primed rolling circle amplification for targeted RNA sequence detection. Scientific reports, 8(1), 7770.
또한, RCA 기술의 원 모양의 template를 만드는 과정은 비특이적인 반응을 막을 수 있습니다.
위 그림에서 보는 것처럼 표적 핵산이 circular template에 정확한 결합하지 않으면 원 모양의 template를 생성하지 못하기 때문에 상대적으로 높은 특이도를 보이는 기술입니다.