지난 포스팅은 EXPAR에 대해 이야기했습니다.
오늘은 loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 기술과 더불어 가장 널리 활용되고 있는 등온 증폭 기술인 recombinase polymerase amplification (RPA)에 대해 알아보겠습니다.
1. Recombinase polymerase amplification (RPA) 특징
1) RPA 기술은 다른 등온 핵산 증폭 기술과 마찬가지로 등온에서 증폭 반응이 진행되기 때문에 열 변화를 필요로 하지 않아 thermal cycler를 필요로 하지 않습니다.
이에 따라 현장진단에 적용하기 용이합니다.
2) RPA 기술은 3가지 단백질을 사용하는 기술로 이름에서도 알 수 있듯이 재조합 효소 (Recombinase)와 DNA polymerase 그리고 single-strand binding protein (SSB)를 사용합니다.
이전의 게시글 등온 핵산 증폭 기술 에서 서술했던 것처럼 등온 핵산 증폭 기술은 이중 가닥의 DNA를 단일 가닥의 DNA로 만들어 프라이머를 붙게 하는 기술이 핵심인데 그것을 구현하기 위해 Recombinase와 SSB가 사용됩니다.
3) 기술은 비교적 낮은 온도인 37-42℃에서 반응이 진행되며 획기적인 기작을 통해 빠른 증폭을 구현할 수 있어 일반적으로 20분 이내에 표적 핵산을 아주 민감하게 검출할 수 있습니다.
4) 또한, 4-6개의 프라이머를 사용하는 LAMP 기술과 달리 PCR처럼 오직 2개의 프라이머만으로 반응을 구현할 수 있어 프라이머를 디자인하기 편하다는 장점이 있습니다.
2. RPA 원리
Recombinase polymerase amplification (RPA) 기술의 원리에 대해 알아보겠습니다.
본 게시글의 앞부분에서 언급했듯이 RPA 기술은 recombinase와 SSB에 의해 이중 가닥의 DNA가 표적 물질로 있을 때도 프라이머를 결합 시키는 것이 기술의 핵심 포인트입니다.
이제 핵산의 증폭 순서에 대해 말씀드리겠습니다.
1) 먼저 이중 가닥의 표적 핵산에 recombinase가 결합하며, 이는 프라이머가 표적 핵산에 결합할 수 있는 환경을 만듭니다.
2) Recombinase에 의해 표적 핵산에 결합한 프라이머는 SSB의 도움을 받아 구조를 안정화 시키게 됩니다.
3) 결합한 프라이머를 시작점으로 DNA polymerase에 의해 DNA 합성이 진행됩니다.
4) 결과적으로 하나의 표적 이중 가닥 DNA에서 두 개의 이중 가닥 DNA를 생성하게 됩니다.
5) 1)-4)의 과정을 반복하여 소량의 이중 가닥 DNA로부터 많은 양의 이중 가닥 DNA를 생성하게 됩니다.
3. 포스팅을 마치며
PCR 기술의 경우에는 온도를 높게 하여 (95℃) 이중 가닥의 denaturation을 구현합니다.
그러나 등온 핵산 증폭 기술의 경우에는 기술마다의 독특한 기작을 통해 denaturation을 구현하는데 recombinase와 SSB를 이용하여 구현한 RPA 기술은 증폭의 효율이 좋아 매우 민감하고 빠르게 표적 핵산을 검출해 낼 수 있습니다.
하지만, 이러한 좋은 기술도 몇 가지의 단점이 있습니다.
반응 효율이 좋은 만큼 recombinase에 의해 핵산이 비특이적으로 결합할 가능성이 있기 때문에 비교적 위양성 (false positive) 문제가 자주 발생합니다.
이러한 경우 기술의 특이도가 낮아지기 때문에 진단의 정확도가 떨어질 수 있습니다.
또한, TwistDXTM 회사의 키트를 사용해야만 기술의 성공적으로 구현할 수 있기 때문에 비교적 시약이 비싸다는 문제점이 있습니다.
이러한 문제점을 해결할 수 있다면 RPA 기술은 증폭 효율이 좋기 때문에 미래에는 널리 진단에 활용될 수 있을 것으로 생각됩니다.