오늘은 phosphorothioated modification이 된 hairpin probe를 사용하여 표적 miRNA를 검출한 논문에 대해 리뷰할 예정입니다.
Phosphorothioated (PS) modification을 하는 이유는 여러 가지가 있지만 논문의 기술에서는 핵산 간의 결합력을 조절하기 위해 사용되었습니다.
또한, 논문에서는 등온 핵산 증폭 기술 중 하나인 loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 방법을 활용하여 표적 물질을 검출하였는데, 일반적으로 LAMP 기술의 경우 짧은 길이의 핵산을 검출하기 어려운데 저자들은 짧은 단일 가닥의 RNA인 miRNA를 성공적으로 증폭하여 검출해냈습니다.
보다 자세한 내용은 논문의 서론과 본론 리뷰를 통해 알아보겠습니다.
1. Phosphorothioated modification (PS) probe 기반 LAMP 기술 서론
저자들은 우선 표적 물질인 miRNA에 대해 언급하며 introduction을 시작하였습니다.
표적 물질인 miRNA는 약 20개의 뉴클레오타이드로 이루어진 작은 RNA로 표적 mRNA에 결합하여 단백질 translation을 억제할 수 있다고 합니다.
또한, 연구에 따르면 miRNA의 농도가 다양한 질병에 관련이 있다고 언급하며 이는 miRNA가 질병의 바이오마커로 활용될 수 있음을 뒷받침했습니다.
그러나, miRNA의 경우 짧은 길이와 같은 miRNA family 사이에서의 염기 서열의 유사성과 비교적 양이 적다는 문제가 있으며 분석하기 까다롭다고 서술했습니다.
이러한 이유로 매우 민감하고 특이적인 miRNA 검출법을 확립하는 것이 필요하다고 이야기하며 quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) 기술이 표준으로 활용되고 있다고 말했습니다.
qRT-PCR 기술이 매우 민감하게 검출하는 방법일지라도 분석 과정이 오래 걸리며 비특이적 증폭으로 인한 거짓 양성 결과의 위험이 있다고 이야기하였으며 현장 진단에 활용하기에도 어려움이 있다고 말했습니다.
이러한 단점을 극복하기 위한 방법으로 다양한 등온 증폭 기반의 miRNA 검출 기술이 개발되고 있다고 이야기하였으며 rolling circle amplification (RCA), strand displacement amplification (SDA), hybridization chain reaction (HCR) 등을 예시로 들었습니다.
※ 이와 관련하여 더욱 다양한 등온 핵산 증폭 기술에 대해 알고 싶으신 분은 본 홈페이지에서 다양한 글을 접하여 지식과 정보를 얻을 수 있습니다.
그중 저자들이 제안한 기술에서 활용된 loop mediated isothermal amplification (LAMP) 기술에 대해 다음으로 이야기를 시작하여 빠른 속도, 훌륭한 민감도, 간단한 조작 그리고 낮은 비용 등의 장점을 열거하며 LAMP 기술이 훌륭함을 이야기하였습니다.
이후 보다 구체적으로 LAMP는 등온에서 반응이 진행되는 기술이며 LAMP 반응에서는 4개의 프라이머가 설계되어 활용된다고 이야기하고 있습니다.
물론 일반적으로 4개가 설계되어 활용된다고 할 수 있지만 제 생각으로는 4-6개 (F3, B3, FIP, BIP, loop primers)의 프라이머가 널리 활용되고 있습니다.
다음으로 논문의 핵심이 되는 요소 중 하나인 phosphorothioated (PS) modification에 대해 이야기하겠습니다.
저자들은 이에 대해 서론에서 거의 언급하지 않았지만 제 생각에는 오히려 이 부분이 본 기술의 novelty를 결정하는 중요한 요소라고 생각했습니다.
PS modification은 DNA backbone에 당-인산 골격의 인산 부분에서 산소가 황으로 대체되는 modification입니다.
이러한 PS modification이 진단 분야에서 활용되는 방식으로 먼저 다양한 nuclease (exonuclease or endonuclease)에 보다 잘 저항할 수 있게 할 수 있습니다.
다음으로는 이번 리뷰하는 논문에서 활용한 것처럼 핵산 간의 결합력을 낮출 수 있음을 활용하여 증폭 기술 및 진단 기술을 설계할 수 있습니다.
보다 자세한 원리는 본문의 scheme을 보며 이야기하도록 하겠습니다.
저자들은 이러한 배경을 바탕으로 reverse transcription 기반의 LAMP 방식을 개발하였다고 이야기하며 제안하는 방법에는 terminal hairpin formation and self-priming (THSP) 방식이 활용되었다고 이야기하였습니다.
또한 stem-loop probe와 PS hairpin probe를 설계하여 표적 miRNA가 stem loop 프로브와 결합한 후 PS hairpin probe와 새롭게 결합하게 되면서 이중 가닥의 DNA를 형성한다고 이야기하였습니다.
2. PS modification과 LAMP 기술을 접목한 표적 핵산 검출 기술
이제 저자들이 제안한 기술의 scheme을 보며 표적 miRNA를 검출하는 과정에 대해 순차적으로 설명하도록 하겠습니다. 저자들이 제안한 기술의 모식도는 아래와 같습니다.
DOI: https://doi.org/ 10.1016/j.aca.2020.06.007
Al-Maskri, A. A. A., Ye, J., Talap, J., Hu, H., Sun, L., Yu, L., … & Zeng, S. (2020).
Reverse transcription-based loop-mediated isothermal amplification strategy for real-time miRNA detection with phosphorothioated probes. Analytica Chimica Acta, 1126, 1-6.
먼저 stem-loop (SL) probe에 표적 miRNA가 결합하게 되고 reverse transcription 반응이 진행되게 됩니다.
그에 따라 생성된 부분은 PS-H probe의 3’ 말단 부분과 결합하게 됩니다.
결과적으로 양쪽에 loop를 가지는 덤벨 모양의 probe가 생기게 되고 DNA polymerase에 의해 긴 이중 가닥의 DNA가 생성되게 됩니다.
위 PS-H probe 부분의 주황색으로 표시된 PS modified DNA 부분은 앞서 저자들의 서론을 리뷰할 때 설명했던 것 정보에 따라 결합력이 PS modification이 되지 않은 DNA보다 약하기 때문에 결합이 풀려 떨어지게 됩니다.
이때 PS modified DNA 부분은 스스로 다시 접힐 수 있는 self-folding이 되게 설계가 되어 있고 이후 FIP와 BIP 두 primer를 통해 지속적인 증폭 반응을 유도할 수 있게 됩니다.
DNA는 OSD probe와 함께 toehold-mediated strand exchange reaction (TMSD) reaction이라는 방식으로 형광을 낸다고 표현하고 있는데 이는 간단하게 말해서 반응 생성물이 있을 경우에는 형광 표지된 DNA가 소광체가 표지된 DNA와 상보적으로 결합하고 있는 것이 아니라 보다 많이 상보적으로 결합할 수 있는 반응 생성물의 loop 부분에 결합하여 형광 신호를 내는 원리를 활용하는 것입니다.
3. 마치며
저자들이 제안한 본 기술은 phosphorothioated modification을 활용한 LAMP 기술입니다.
저는 표적 miRNA의 경우 LAMP 기술로 검출하는데 어려움이 있다고 생각합니다.
왜냐하면, miRNA 자체가 LAMP primer가 붙을 만한 충분한 길이가 확보되지 않기 때문입니다.
저자들은 이를 SL primer와 PS hairpin probe를 활용하여 극복하였습니다. 물론 SL primer는 일반적으로 miRNA를 검출하기 위한 PCR에서도 활용되는 방식이긴 하지만 이를 LAMP에 적용한 것이 기술의 핵심이었다고 생각합니다.