오늘은 Peroxidase mimicking DNAzyme 기반 검출 논문을 리뷰할 예정입니다.
일반적으로 단백질 효소 (enzyme)은 catalytic activity를 가지고 있는 물질로 널리 알려진 소화를 돕는 amylase, lipase 등이나 DNA를 합성하는 DNA polymerase 등 다양한 enzyme들이 몸에서 적절하게 사용되고 있습니다.
특별한 구조에서 enzyme (단백질 효소)과 같은 활성을 띄는 DNA를 DNAzyme이라고 합니다.
한편 단백질이 아닌 특정 염기서열을 가지는 DNA도 금속 이온과 함께 특수한 구조를 이루어 enzyme과 유사한 활성을 보이는 경우가 있는데 이를 DNAzyme이라고 합니다.
RNA가 금속 이온과 함께 특수한 구조를 이루는 경우는 RNAzyme이라고 하며 이러한 DNAzyme, RNAzyme은 절단, 합성 효소 역할도 수행합니다.
1. 논문 서론
논문에서는 서론에서 표적 핵산인 microRNA에 대해 설명하고 있습니다.
miRNA는 18-24개의 염기 서열을 가지는 짧은 단일 가닥의 RNA로 유전자 발현에 영향을 주는 RNA입니다.
miRNA는 암 치료를 위한 cancer biomarker로 활용되어 암 진단에 활용된다고 서술하고 있습니다.
하지만, miRNA는 양이 매우 적고 길이가 짧으며 유사한 miRNA family끼리 sequence 유사도가 매우 높고 쉽게 degradation 된다는 문제가 있기 때문에 정확한 검출이 어렵다는 문제가 있습니다.
이를 검출하기 위해 현재 표준으로 사용되는 기술은 다들 알고 있는 reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) 기술입니다.
RT-PCR 기술은 민감도와 특이도가 높다는 장점이 있지만 크기가 크고 비싼 thermal cycler를 필요로 하는 단점이 있습니다.
이러한 RT-PCR 기술의 문제점을 극복하기 위해 연구되고 있는 증폭 방법이 등온 핵산 증폭 기술입니다.
널리 활용되는 등온 핵산 증폭 기술로 loop-mediated isothermal amplification (LAMP), recombinase polymerase amplification (RPA), nucleic acid sequence based amplification (NASBA) 등의 기술이 있으며 본 논문에서는 rolling circle amplification (RCA)를 이용하여 miRNA 진단에 활용하였습니다.
다음으로 유명한 DNAzyme 중 하나인 G quadruplex DNAzyme에 대해 서술하며 peroxidase mimicking activity를 활용하여 검출한 기술에 대해 서술하고 있습니다.
그러나, G quadruplex DNAzyme을 RCA 기술을 통해 생성한 경우 분자 간 혹은 분자 내 잘못 접히거나 뭉치는 경우가 생길 수 있는 문제를 말했습니다.
G triplex가 이를 해결하기 위한 훌륭한 대안으로 이야기되며 G quadruplex와 유사하지만 비교적 길이가 짧기 때문에 활용되기 더 좋다고 말하고 있습니다.
2. Peroxidase mimicking DNAzyme 기반 검출 기술
본 기술의 검출 모식도를 보기에 앞서 아래 그림에 대해 설명하고 모식도 설명을 이어가도록 하겠습니다.
DOI: https://doi.org/10.1007/s00604-019-4093-2
Li, R., Liu, Q., Jin, Y., & Li, B. (2020). Sensitive colorimetric determination of microRNA let-7a through rolling circle amplification and a peroxidase-mimicking system composed of trimeric G-triplex and hemin DNAzyme. Microchimica Acta, 187, 1-8.
서론에서 저자는 G quadruplex와 G triplex의 효율이 비슷하다고 이야기하였으며 위 실험 결과를 보면 두 DNAzyme의 활성이 비슷한 것을 알 수 있습니다.
여기서 중요한 점은 G rich sequence들이 연속적으로 있는 multimer인 경우 활성 차이가 생기는데 G triplex가 2개나 3개 연속적으로 연결된 G triplex dimer나 G triplex trimer의 경우 보다 높은 활성을 보이는 것을 확인하여 저자들은 이를 miRNA를 검출하기 위한 기술에 활용하였습니다.
논문에서 제안한 기술은 표적 miRNA가 있는 경우 padlock probe에 결합하게 됩니다.
miRNA와 padlock probe는 중간에 1개의 base를 제외하고 모두 결합한 상태입니다. 이때 RNA ligase에 의해서 Padlock probe의 양 끝 말단이 연결되어 원형의 DNA가 됩니다.
생성된 원형의 DNA는 miRNA를 프라이머로 하여 DNA polymerase에 의해 긴 단일 가닥의 반응 산물을 만들어 냅니다.
원형의 DNA는 G triplex trimer와 상보적인 염기서열을 가지고 있기 때문에 반복적으로 G3 triplex trimer를 생성하게 됩니다.
G triplex trimer는 hemin 분자와 결합한 후 peroxidase mimicking 활성을 이용하여 ABTS 물질을 산화시키게 되고 결과적으로 비색으로 최종 신호를 발생시킵니다.
3. 논문 리뷰를 마치며
G-rich sequence 중 peroxidase mimicking activity를 가지는 G triplex를 활용한 miRNA 검출 논문에 대해 알아봤습니다.
논문에서 흥미로운 점은 일반적으로 진단에 활용되는 G quadruplex가 아닌 길이가 짧은 G triplex의 장점을 활용한 점과 그것을 여러 개 연결한 G triplex trimer를 통해 보다 민감하게 표적 miRNA를 검출했다는 점이 흥미로운 기술이었습니다.