오늘은 RNA 생성물로 하는 고효율의 등온 증폭 기술이며 Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), RPA 기술과 더불어 널리 활용되고 있는 nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) 기술에 대해 알아보도록 하겠습니다.
1. NASBA 등온 증폭 기술의 특징
NASBA 등온 증폭 기술의 특징에 대해 알아보겠습니다.
1) NASBA 기술의 가장 큰 특징 중 하나는 RNA를 표적 물질로 하여 RNA를 생성하는 기술이라는 것입니다.
앞서 언급한 LAMP, RPA 그리고 EXPAR 기술은 모두 DNA를 최종 생성물로 가지는 기술입니다.
2) 다른 등온 핵산 증폭 기술과 마찬가지로 열 순환기(thermal cycler)를 필요로 하지 않아 현장진단에 적용하기 용이합니다.
3) NASBA 기술은 reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase 3가지 단백질을 사용하는 기술입니다.
등온 핵산 증폭 기술의 핵심은 이전의 게시글 등온 핵산 증폭 기술에서 서술했던 것처럼 이중 가닥의 중간 생성물이나 표적 핵산에 프라이머를 붙게 하는 기술이 핵심인데 그것을 구현하기 위해 RNase H가 사용됩니다.
4) NASBA 기술은 낮은 온도인 41℃에서 반응이 진행되며 2개의 프라이머 (Forward, reverse primer) 사용하는 기술입니다.
2. NASBA 등온 증폭 기술의 원리
NASBA 등온 증폭 기술의 원리에 대해 알아보겠습니다.
일반적으로 단순하게 프라이머가 붙고 DNA polymerase에 의해 DNA 생성물을 만드는 방식과 다르게 reverse transcriptase와 RNase H, T7 RNA polymerase를 사용하여 RNA 생성물을 만드는 기술입니다.
1) 먼저 표적 RNA에 T7 promoter를 포함하는 reverse 프라이머가 결합합니다.
(T7 promoter는 T7 RNA polymerase가 인식하는 염기서열입니다.)
2) 표적 RNA를 주형으로 하여 reverse transcriptase의 활성으로 cDNA를 생성합니다.
3) RNase H 활성을 통해 RNA가 모두 제거됩니다.
(RNase H는 RNA-DNA 이중 가닥에서 RNA를 제거하는 활성을 가지고 있습니다.)
4) RNA가 제거되고 남은 단일 가닥의 DNA에 forward 프라이머가 결합합니다.
5) Reverse transcriptase 활성을 통해 이중 가닥의 DNA를 생성합니다.
6) 생성된 이중 가닥의 DNA는 T7 promoter를 포함하고 있기 때문에 T7 RNA polymerase가 인식하여 T7 promoter 이후의 서열에 대해 RNA를 대량으로 생성하게 됩니다.
7) 또한, 생성된 RNA는 표적 RNA에 대해 상보적인 염기서열로 forward 프라이머가 결합할 수 있습니다.
8) Reverse transcriptase와 RNase H 활성을 통해 forward 프라이머로부터 생성된 cDNA가 만들어가지게 됩니다.
9) Reverse primer가 생성된 cDNA에 결합하게 되고 reverse transcriptase에 의해 5) 과정에서 와 동일한 이중 가닥의 DNA를 생성하게 됩니다.
10) 추가적으로 생성된 이중 가닥의 DNA를 활용하여 더욱 많은 RNA 생성물을 만들게 됩니다.
3. 글을 마치며
NASBA 기술은 RNA를 표적으로 하여 RNA 생성물을 만드는 획기적인 등온 핵산 증폭 기술입니다.
또한 원리에서 설명했듯이 T7 RNA polymerase에 의해 생성된 RNA 생성물이 표적 핵산과 유사한 역할을 할 수 있기 때문에 더욱 민감하게 표적 RNA를 검출할 수 있다는 장점이 있습니다.
특히 SARS-CoV-2와 같은 RNA 바이러스를 검출하는 데 있어 추가적인 reverse transcription 반응을 하지 않아도 되는 장점이 있어 감염성 바이러스 진단에 있어 매우 유용한 기술입니다.
하지만 시약 값이 비싸기 때문에 아직 널리 활용되지 못하는 기술이지만 이를 극복한다면 진단에 활발히 활용될 수 있을 것으로 생각됩니다.