DNA를 주형으로 하여 RNA를 생성하는 In vitro transcription (IVT) 방법은 매우 높은 생성 효율을 보이는 기술로 증폭에 활용되기 좋은 핵심 기술입니다.
COVID-19 팬데믹 시기 많은 사람들이 맞았던 mRNA 기반 백신 또한 IVT을 통해 생성된 백신입니다.
훌륭한 증폭 효율 덕분에 진단에도 널리 활용될 수 있으며 RNA를 표적으로 하는 유전자 가위인 CRISPR Cas13a 시스템이나 light up aptamer를 생성하여 형광 신호를 발생시킬 때 사용할 수 있습니다.
1. In vitro transcription (IVT)을 활용한 증폭 시스템 원리
Transcription-based amplification system (TAS)를 이해하기 위해서는 IVT 방식에 대해 알아야 합니다.
오늘은 IVT의 원리보다는 진단에 활용되는 부분에 대해 중심적으로 이야기할 예정이므로, IVT의 원리나 내용이 궁금하시면 아래 글을 읽으시면 자세히 알 수 있습니다.
본 게시글의 내용을 이해하기 위해 간단하게 설명하도록 하겠습니다.
IVT은 다른 증폭 기술 대비 낮은 온도 (37-42℃)에서 반응이 진행되며 주형으로 사용되는 DNA와 RNA polymerase 그리고 RNA polymerase가 인식할 수 있는 프로모터가 필요합니다.
※ 대표적으로 T7 RNA polymerase가 널리 활용되고 있습니다.
T7 promoter를 포함하는 이중 가닥의 DNA가 있을 경우 RNA polymerase가 결합하여 T7 promoter에 상보적으로 결합한 DNA로부터 RNA를 생성하게 됩니다.
2. Nucleic acid sequence-based amplification NASBA
Transcription을 활용한 대표적인 등온 핵산 증폭 기술은 NASBA 반응이 있습니다.
표적 RNA가 있을 때 reverse 프라이머가 표적 핵산에 결합한 후 reverse transcriptase에 의해 cDNA가 생성됩니다.
이후 RNase H 활성에 의해 표적 RNA가 제거되고 forward 프라이머가 결합하여 T7 promoter를 포함하는 이중 가닥의 DNA를 생성하게 됩니다.
생성된 이중 가닥의 DNA는 transcription 반응을 통해 수없이 많은 RNA 생성물을 만들게 됩니다.
또한 생성된 RNA는 forward primer와 함께 추가적인 T7 promoter를 포함하는 이중 가닥의 DNA를 생성하여 기하급수적으로 증폭 효율을 향상시킵니다.
이러한 반응을 통해 생성된 RNA는 위의 그림과 같이 molecular beacon과 결합하여 형광을 발생시킬 수도 있지만 다른 방안으로 신호를 발생시키는데 활용될 수 있습니다.
NASBA 기술에 대한 내용은 아래 별도의 포스팅으로 잘 정리되어 있습니다.
3. 크리스퍼 카스 13 시스템과 함께 사용되는 IVT 기술
유전자 가위 중 하나인 크리스퍼 카스13 시스템은 특이적으로 표적 RNA를 인식할 뿐 아니라 신호를 크게 증폭시킬 수 있어 진단에 많이 활용되고 있습니다.
CRISPR Cas13 시스템은 crispr RNA (crRNA)가 상보적인 RNA를 인식하면 주변의 RNA를 비특이적으로 절단하는 특성을 가지고 있습니다.
이러한 비특이적 절단을 통해 주변에 있는 RNA reporter를 자르게 되고 형광 신호나 lateral flow assay등의 방법으로 진단에 활용되고 있습니다.
대표적으로 사용되는 증폭 기술인 PCR, RPA, LAMP 등은 이중 가닥의 DNA를 반응 산물로 하기 때문에 CRISPR Cas13 시스템과 함께 사용하기 위해서는 IVT 반응을 진행하여 이중 가닥의 DNA로부터 RNA를 생성해야 합니다.
4. Light-up aptamer를 활용한 진단 기술
Aptamer란 염기서열 간의 상보적인 결합이 아닌 특정 분자와 결합할 수 있는 핵산으로 마치 항원-항체 반응과 유사한 특징을 가지고 있습니다.
단백질, 작은 분자 그리고 이온 등을 인식할 수 있는 aptamer들이 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)라는 방식을 통해 발굴되고 있습니다.
이러한 aptamer 중 RNA light up aptamer는 특정 분자와 결합하여 형광을 증가시키는 특별한 aptamer입니다.
RNA light up aptamer와 결합하는 분자는 결합하기 전에는 형광이 아예 없거나 매우 약한 형광을 가지는 작은 분자 (ligand)로 aptamer에 대한 높은 결합력을 가지고 있습니다.
RNA light up aptamer 중 널리 연구되고 있는 aptamer로는 spinach aptamer나 mango aptamer가 있습니다.
이러한 RNA aptamer를 생성하기 위한 주형 DNA로부터 IVT 반응을 통해 수없이 많은 RNA aptamer를 생성하면 그에 따라 높은 형광 신호를 얻을 수 있습니다.