In vitro transcription (IVT) 방법은 DNA를 주형으로 하여 RNA를 생성하는 기술로 진단, 생물학 및 생화학 분야에 다양하게 활용되는 핵심 기술입니다.
IVT 방법 자체가 매우 높은 효율을 보이기 때문에 단독으로 진단에 활용되기도 하지만 PCR 그리고 등온 핵산 증폭 기술 중 LAMP, EXPAR, RPA 등 최종 반응 산물이 이중 가닥의 DNA인 경우 최종 산물로 RNA를 얻으려 할 때 추가적으로 반응을 진행하여 RNA를 얻습니다.
오늘은 IVT에 대한 구체적인 원리와 더욱 효율을 높인 연구에 대해 알아보도록 하겠습니다.
1. In vitro transcription (IVT) 원리
IVT를 진행하기 위해서는 우선 주형 DNA가 있어야 하며 RNA polymerase가 인식할 수 있는 프로모터 염기서열을 가지고 있어야 합니다.
일반적으로 널리 활용되는 RNA polymerase로는 T7 RNA polymerase가 있으며 rNTP (ribonucleotide tri-phosphate)를 필요로 합니다.
In vitro transcription은 비교적 낮은 온도 (37-42℃)에서 반응이 진행됩니다.
위 그림에서 보는 것처럼 T7 promoter (TAATACGACTCACTATA)를 포함하는 염기서열에서 RNA polymerase가 프로모터 염기서열을 인식한 후 GGG 부분을 시작으로 RNA로 생성하게 됩니다.
※ Guanine이 세 개 반복되는 부분이 전사의 시작점인 이유는 다른 염기서열이 있을 때 보다 GGG 염기서열로 시작하는 것이 반응 효율이 높기 때문입니다.
위 모식도에서 T7 promoter 이후에 초록색 염기 서열이 없어도 검은색 부분을 주형으로 하여 RNA를 생성할 수 있습니다.
이러한 간단한 반응의 IVT 기술은 매우 높은 반응 효율을 가지고 있기 때문에 소량의 DNA 주형을 가지고도 많은 양의 RNA를 생성할 수 있습니다.
2. Promoter의 길이에 따른 IVT 반응 효율
대부분의 IVT을 수행할 때 긴 20 base의 promoter를 사용해왔습니다.
최근 논문에서 promoter의 길에 따라 반응 효율이 바뀌는 논문이 있어 IVT 원리 설명과 함께 논문 내용을 소개하려고 합니다.
DOI: https://doi.org/10.1039/D0CC07797F
Woo, J., Kim, J. H., Kim, S., & Park, K. S. (2021). Promoter engineering improves transcription efficiency in biomolecular assays.
Chemical Communications, 57(13), 1619-1622.
위 논문에서는 일반적으로 사용되던 20 base의 T7 promoter 보다 12 ~ 16 base의 T7 promoter가 더욱 반응 효율이 좋다는 것을 실험적으로 입증하였습니다.
물론, 아직도 20 base의 T7 promoter가 널리 사용되고 있지만 위 논문을 바탕으로 더욱 높은 효율의 IVT 반응을 구현할 수 있을 것으로 생각됩니다.
3. IVT 활용
IVT 기술은 높은 효율로 RNA를 생성하는 기술로 진단에 다양한 방법으로 활용될 수 있습니다.
이번 COVID-19 팬데믹 때 많은 사람들이 mRNA 백신을 맞았는데 이를 만들기 위해서 IVT 기술이 사용됐습니다.
또한, 유전자 가위인 CRISPR Cas13a 시스템은 RNA를 표적으로 인식한 후 주변의 RNA를 비특이적으로 잘라 신호를 발생시키는데 이에 활용 가능합니다.
그 외에도 전사 반응을 활용한 대표적인 등온 핵산 증폭 방법으로 NASBA 방법이 있습니다.
NASBA 반응은 이러한 IVT의 높은 효율 덕분에 표적 RNA에 대한 높은 민감도와 특이도를 보이는 기술입니다.
더욱이 최종 산물로 RNA light-up aptamer를 생성하게 되면 특정 분자를 RNA가 인식했을 때 형광을 발생시키는 점을 이용하여 진단에 활용할 수도 있습니다.
위에 설명한 CRISPR Cas13 기술이나 NASBA 기술이 궁금하신 분들은 아래 글을 참고해 주시기 바랍니다.