오늘은 등온 증폭 기술 Exponential amplification reaction (EXPAR)에 대해 알아보겠습니다.
지난 시간에는 현재 가장 많이 활용되어 상용화가 진행된 loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 기술에 대해 알아봤습니다.
LAMP 기술은 다른 등온 핵산 증폭 기술 대비 높은 민감도와 빠른 검출 시간을 가지고 있지만, 여러 개의 프라이머를 설계해야 하기 때문에 디자인하는데 어려움이 있습니다.
보다 단순하지만 빠르게 핵산을 증폭시킬 수 있는 기술이 바로 EXPAR입니다.
1. Exponential amplification reaction (EXPAR) 특징
EXPAR 기술의 특징에 대해 알아보겠습니다.
1) 등온 핵산 증폭 기술은 EXPAR 기술은 핵산을 증폭하기 위해 지속적인 열 변화를 필요로 하지 않아 열 순환기 (thermal cycler)를 필요로 하지 않습니다.
2) 표적 핵산이 결합할 수 있는 단일 가닥 하나만 설계하면 되기 때문에 반응을 설계하기도 쉽습니다.
3) DNA polymerase와 nicking endonuclease 두 개의 enzyme을 사용하는 기술이며, 다양한 조합의 중합 효소와 절단효소를 사용할 수 있습니다.
일반적으로 37℃ (Klenow fragment + Nt. alwI)이나 55℃ (Vent DNA polymerase + Nt.BstNBI)에서 반응을 진행합니다.
4) 다른 증온 핵산 증폭 기술과 비교했을 때 짧은 가닥의 DNA나 RNA를 검출할 때 많이 활용됩니다.
2. EXPAR 기술 원리
이제 EXPAR 기술의 원리에 대해 알아보겠습니다.
DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gks230
Qian, J., Ferguson, T. M., Shinde, D. N., Ramírez-Borrero, A. J., Hintze, A., Adami, C., & Niemz, A. (2012).
Sequence dependence of isothermal DNA amplification via EXPAR. Nucleic acids research, 40(11), e87-e87.
위에서 언급했듯이 EXPAR 기술은 하나의 단일 가닥 DNA (EXPAR template)에 의해 반응이 진행됩니다.
EXPAR template는 표적 핵산에 대해 상보적인 염기서열과 절단 효소 인식 서열 그리고 다시 한번 표적 핵산에 대한 상보적인 염기서열로 구성되어 있습니다.
1) 먼저 표적 핵산이 EXPAR template의 3’ 말단에 결합합니다.
2) DNA polymerase에 의해 이중 가닥의 DNA를 형성합니다.
3) Nicking enzyme에 의해 절단 효소 인식 서열에서 절단이 일어나고 다시 DNA polymerase에 의해 이중 가닥의 DNA가 생성됩니다.
4) 기존 생성됐던 DNA (절단 효소 인식 서열의 뒷부분)은 3) 반응이 진행될 때 strand displacement의 원리로 떨어져 나오게 됩니다.
5) 떨어져 나온 생성된 DNA는 다시 새로운 EXPAR template에 결합하여 위 과정을 반복 진행하게 됩니다.
이러한 간단하지만 효과적인 증폭 방식을 활용하여 매우 높은 민감도로 표적 핵산을 검출해 낼 수 있습니다.
DOI: https://doi.org/10.1039/C6RA18225A
Tang, W., Zhang, T., Li, Q., Wang, H., Wang, H., & Li, Z. (2016).
Sensitive detection of tumor cells based on aptamer recognition and isothermal exponential amplification. RSC advances, 6(92), 89888-89894.
EXPAR 반응의 민감도를 높이거나 다양한 방식으로 생성된 단일 가닥의 DNA를 활용하기 위해 2개의 EXPAR template을 사용하는 기술도 연구되고 있습니다.
위의 증폭 반응을 보면 EXPAR template I에 의해 생성된 단일 가닥의 DNA가 EXPAR template II의 반응을 유도 시키는 것을 볼 수 있습니다.
3. 마치며
간단하지만 빠르며 비교적 저온에서 핵산을 증폭 시킬 수 있는 EXPAR 기술은 유망한 등온 핵산 증폭 기술입니다.
높은 검출 민감도를 보이는 기술이지만 짧은 가닥의 DNA나 RNA를 검출할 때 사용할 수 있으며 false signal 문제가 있을 수 있다는 단점이 있습니다.
하지만, 이를 극복하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있기 때문에 미래에는 단점을 극복하여 널리 진단에 활용될 수 있을 것으로 생각합니다.