오늘은 DNA methylation을 검출하여 암을 진단할 수 있는 기술에 대한 리뷰를 진행하겠습니다.
Methylation은 후성유전학적 변형 중 하나로 다양한 유전자 조절에 관련이 있습니다.
하지만, 특별하게 methylation 변형이 생긴 DNA를 검출하는 것은 어려움이 있으며 그 양 또한 매우 적기 때문에 일반적으로 검출하기에 어려움이 있습니다.
이를 극복하기 위해 검출하려고 하는 핵산의 양을 늘리기 위한 핵산 증폭 과정이 필요로 하게 되고 그를 등온 핵산 증폭 기술 중 하나인 loop mediated isothermal amplification (LAMP) 방식을 활용하였습니다.
LAMP의 경우 높은 증폭 효율과 민감도를 바탕으로 효과적으로 핵산을 증폭시키는 기술이며 다양한 방식의 최종 signal을 낼 수 있는 장점이 있습니다.
또한 최근에 더욱 민감도를 높이고 특이도를 높이기 위한 방식으로 등온 핵산 증폭 기술과 유전자 가위인 CRISPR 단백질을 함께 활용하는 기술이 많이 개발되고 있습니다.
그중 LAMP 반응과 함께 활용되는 CRISPR Cas12a 시스템을 이용하여 민감도와 특이도를 높인 기술로 성공적으로 DNA methylation을 검출한 기술입니다.
보다 자세한 내용은 저자들이 논문에서 제시한 서론과 본론을 보며 설명하도록 하겠습니다.
1. 등온핵산증폭과 유전자 가위 시스템을 활용한 DNA methylation 검출 서론
저자들은 서론에서 우선 표적 물질인 DNA methylation에 대해 이야기하고 있습니다.
앞서 처음 시작에 언급했던 것처럼 DNA methylation은 가장 흔하고 특징적인 후성유전학적 변형 중 하나로 유전자 조절 및 다양한 생물학적 과정과 밀접한 관련이 있는 변형입니다.
발암 유전자의 promoter 영역에서 비정상적인 DNA methylation은 암을 포함한 여러 질병의 기전에 연관이 있어 바이오마커로 활용될 수 있습니다.
저자들이 말하기를 오늘날의 암의 조기 진단과 예후는 순환 종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)를 검출하는 액체 생검 (Liquid biopsy) 기술에 점점 더 의존하고 있다고 서술했습니다.
Methylation된 ctDNA는 항상 methylation 되지 않은 DNA가 함께 존재하기 때문에 결과적으로 메틸화된 빈도는 0.01%에 불과하며 실제로 plasma 1mL에 ctDNA가 거의 수 개의 copy만 존재한다고 보고되었다고 합니다.
이를 감지하기 위해선 양이 매우 적은 tumor specific한 DNA 메틸화된 바이오마커를 고감도 및 특이적으로 검출하는 기술 개발이 요구된다고 설명하였습니다.
한 번에 많은 양을 처리하는 DNA sequencing 방식은 DNA 메틸화에 대한 전반적인 정보를 제공하였으나, sequencing 방법은 값비싼 장비와 시약 그리고 복잡한 절차와 데이터 처리 과정을 필요로 한다는 단점이 있습니다. 현재 그중에서 bisulfite 변환 기반 방법은 표준으로 이용되며 비메틸화된 사이토신(C)을 우라실(U)로 변환하고 methylation된 사이토신은 변하게 하지 않습니다.
Methylation sensitive restriction endonuclease (MSRE) 기반의 방법은 DNA methylation 검출을 위한 대안이 되는 방법으로 MSRE는 인식하는 부분에서 메틸화되지 않은 DNA를 두 개의 작은 조각으로 절단하고 메틸화된 DNA는 절단되지 methylation 유무에 따라 효율적이며 성공적으로 분리 및 식별을 가능하게 합니다.
물론, MSRE의 인식 염기 서열은 제한이 되지만, 새로 발견된 MSRE의 수가 증가하면서 이 문제는 해결되고 있다고 합니다. 이를 훌륭한 핵산 증폭 기술 반응을 통해 검출할 수 있으며 대표적으로 polymerase chain reaction (PCR 반응 그리고 exponential amplification reaction (EXPAR), recombinase polymerase amplification (RPA) 그리고 loop mediated isothermal amplification (LAMP) 방식들이 MSRE 기반 전략에 활용되고 있으나 여전히 민감도가 충분하지는 못하다고 서술하였습니다.
이후 저자들은 보다 구체적으로 LAMP 반응에 대해 설명하며 LAMP는 4개의 프라이머를 사용하여 루프가 가지는 DNA를 형성하는 방법으로 다른 증폭 방법과 비교했을 때 상대적으로 긴 DNA 가닥을 template으로 사용해야 한다고 합니다.
LAMP를 사용하여 MSRE 처리된 DNA를 증폭함으로써, 일전에 저자들의 연구팀은 특정 위치의 DNA 메틸화를 실시간 모니터링하는 기술을 개발하였었다고 서술했습니다.
하지만 일전에 개발한 기술로는 단일 분자 검출에는 실패하였는데 이유는 하나의 표적이 단 하나의 이중 loop DNA를 생성하기 때문에 효율이 낮았다고 합니다.
그렇기 때문에 검출 민감도를 높이기 위한 반응에 대해 고민했던 것 같습니다.
결과적으로 저자들은 LAMP 기술을 활용하여 DNA 메틸화에 대한 초고감도 (분자 단위) 검출을 위한 MSRE 기반 방법을 제안하였습니다.
단일 SMRE의 효율적인 절단을 통해 서론에서 언급한 대로 methylation된 DNA와 methylation이 되지 않은 DNA를 효과적으로 구별하였습니다.
Methylation 되지 않은 DNA는 절단되기 때문에 이후 증폭 반응을 유도하지 못하지만 methylation된 DNA는 증폭 반응을 진행하게 됩니다.
마지막으로 CRISPR Cas 시스템과 함께 활용되어 추가적인 신호 증폭 능력과 특정 염기서열을 인식하는 성능이 추가되었습니다.
결과적으로 단일 MSRE 기반 연쇄 증폭 반응과 CRISPR Cas 시스템을 활용한 본 기술을 통해 단일 분자 수준에서 특정 위치의 DNA methylation을 매우 민감하고 특이적으로 확인할 수 있는 플랫폼을 제안했다고 하였습니다.
이제 본문에서 저자들이 제안한 기술의 scheme을 보며 구체적으로 알아보도록 하겠습니다.
2. LAMP 기술과 CRISPR Cas 12a 시스템을 활용한 DNA methylation 검출 기술
저자들이 제안한 기술의 모식도는 다음과 같습니다.
DOI: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c03638
Pataer, P., Zhang, P., & Li, Z. (2024).
Single Methylation Sensitive Restriction Endonuclease-Based Cascade Exponential Amplification Assay for Visual Detection of DNA Methylation at Single-Molecule Level. Analytical Chemistry.
모식도를 보며 순차적으로 기술의 흐름을 설명하도록 하겠습니다.
우선 기술의 핵심이 되는 Hpall에 대해 설명하자면 이는 DNA에서 5’-CCGG-3’를 특이적으로 인식하는 methylation sensitive restriction endonuclease입니다.
먼저 methylation된 DNA와 methylation이 되지 않은 DNA를 구분하는 방식은 표적 핵산에 앞서 언급한 Hpall enzyme이 methylation된 부분을 자르지 않는다면 이는 그대로 이중 가닥의 DNA이기 때문에 추후 LAMP 반응에 활용되게 되지만 DNA methylation이 되어 있지 않다면 그 부분이 잘리게 되어 이후 진행되는 LAMP 반응이 진행되지 않게 됩니다.
결과적으로 DNA methylation이 된 경우에만 LAMP 반응이 진행되어 긴 이중 가닥의 중간중간에 loop를 가지는 DNA가 생성되게 됩니다.
이는 이후 CRISPR Cas12a 시스템의 crRNA에 특이적으로 결합하게 되어 그것의 trans cleavage를 활성화시키게 되고 주변의 단일 가닥의 DNA reporter를 비특이적으로 절단하게 됩니다.