이번 포스팅은 유전자 가위를 활용한 핵산 검출 기술인 DETECTR 기술의 논문을 리뷰하려고 합니다.
DETECTR 기술은 세계적으로 유명한 학술지인 nature biotechnology에 나온 논문이며 SARS-CoV-2 virus를 높인 민감도와 특이도로 검출하였습니다.
DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter의 줄임말인 DETECTR 기술은 유전자 가위인 CRISPR Cas12와 등온 핵산 증폭 기술인 LAMP 기술을 함께 사용한 기술이며 CRISPR Cas의 신호 증폭 성능과 LAMP 기술의 핵산 증폭 성능이 합해져 매우 효율이 좋은 기술입니다.
1. 논문의 서론
논문의 서론에서는 2019년 중국에서 시작된 SARS-CoV-2 바이러스에 의한 감염병인 COVID-19에 대해 이야기하고 있습니다.
본 논문은 2020년에 나온 논문이므로 당시 상황이 얼마나 심각했는지에 대해 서술하고 있습니다.
지난 40년 동안 HIV, SARS, MERS, 인플루엔자, 에볼라, 지카 등의 감염성 바이러스 등에 의한 대규모 질병이 발생하였다는 이야기와 더불어 신속하고 정확한 분자 진단 검사가 필요하다고 저자들이 이야기했습니다.
감염성 질병을 막기 위한 분자 진단 기술의 표준 기술로 polymerase chain reaction (PCR) 기술이 있지만 큰 크기의 기기를 필요로 하기 때문에 휴대하기가 어렵고 결과를 얻을 때까지 오랜 시간이 걸리는 문제가 있다고 이야기하였습니다.
이에 따라, RT LAMP (reverse transcription loop mediated isothermal amplification) 방법과 CRISPR Cas12a를 함께 사용한 DETECTR 기술을 개발하였다고 이야기하고 있습니다.
2. DETECTR 기술에 대한 설명
DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4
Broughton, J. P., Deng, X., Yu, G., Fasching, C. L., Servellita, V., Singh, J., … & Chiu, C. Y. (2020).
CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature biotechnology, 38(7), 870-874.
이제 위 모식도를 보고 DETECTR 기술에 대해 이해하기 쉽게 설명하도록 하겠습니다.
먼저 환자의 샘플로부터 얻은 검체로부터 RNA를 추출합니다.
(매뉴얼로 핵산 추출을 진행하였을 때는 10분이 소요되고, 자동화된 시스템을 사용했을 때는 60분이 소요되었다고 합니다.)
이후 추출된 핵산을 증폭하기 위해 RT-LAMP 반응을 진행하였습니다. 일반적인 LAMP 반응이 아니라 reverse transcription LAMP를 진행한 이유는 LAMP 반응이 DNA를 표적 물질로 하여 증폭하는 기술이기 때문에 reverse transcription을 통해 RNA로부터 DNA를 생성하는 과정이 필요하기 때문입니다.
또한 SARS-CoV-2의 E gene (Envelope gene)과 N gene (Nucleoprotein gene)을 모두 검출한 것을 볼 수 있는데 이것을 통해 잘못된 신호인 위양성 혹은 위음성의 확률을 획기적으로 줄일 수 있습니다.
RT-LAMP 반응 결과 많은 양의 이중 가닥의 DNA가 생성되게 됩니다.
CRISPR Cas12a 시스템의 경우 이중 가닥의 DNA를 인식할 때 PAM (protospacer-adjacent motif) 염기 서열을 인식하여 그 부분은 이중 가닥의 DNA에 있습니다.
CRISPR Cas12a 시스템은 이중 가닥의 DNA를 인식하여 주변의 단일 가닥의 DNA를 비특이적으로 자르는 활성을 띄게 되고 그 결과 주변의 DNA reporter가 절단되게 됩니다.
DNA reporter는 짧은 단일 가닥의 DNA로 한쪽 말단에는 형광 물질을 반대쪽 말단에는 quencher가 표지된 프로브입니다.
잘리기 전에는 형광 물질과 quencher가 가깝기 때문에 형광이 발생하지 않지만 잘리고 나면 둘 사이의 거리가 멀어져 형광이 발생하게 되고 이에 따라 환자의 감염 여부를 확인할 수 있게 됩니다.
논문에서는 형광으로 표적 핵산을 검출하는 것뿐 아니라 lateral flow assay (LFA) 방식을 통해 감염 여부를 확인하였습니다.
LFA 방식은 자가 진단키트에서 사용되는 원리인 항원 항체 반응 같은 원리를 활용한 방식입니다.
간략하게 소개하자면 LFA strip에는 biotin이라는 물질이 붙을 수 있는 control line과 gold-anti FAM antibody가 붙을 수 있는 test line이 존재합니다.
LFA 방식에서는 한쪽 말단에는 FAM (형광 물질)을 반대쪽 말단에는 biotin을 표지한 DNA reporter를 사용합니다.
우선 LFA strip의 끝부분인 LFA pad에 있는 gold-anti FAM antibody들이 모두 FAM 부분에 결합하게 됩니다.
만약에 표적 핵산이 없어 DETECTR 반응이 진행되지 않았을 때는 모든 FAM과 biotin이 하나의 DNA reporter에 붙어 있기 때문에 control line에만 밴드가 뜨게 되고 만약에 DETECTR 반응이 표적 핵산에 의해 진행되면 FAM만 남은 reporter가 test line까지 흘러가게 되어 test line에 밴드가 나타나게 되고 이를 통해 감염 여부를 확인할 수 있습니다.
3. DETECTR 기술에 대한 나의 의견
논문에서는 실험 결과 매우 높은 민감도 (10 copies)의 민감도로 SARS-CoV-2 virus를 40분 이내에 검출하는데 성공하였습니다.
또한, 수많은 환자 샘플에서 높은 임상 민감도와 특이도를 보여 기술의 임상 유효성을 입증하였습니다.
이러한 결과는 PCR 기술과 비교하였을 때도 유사하거나 더 높은 효율을 보이는 것으로 DETECTR 기술의 우수한 성능을 입증한 것입니다.
CRISPR Cas12a를 등온 핵산 증폭 기술 중 하나인 LAMP 반응과 함께 사용한 DETECTR 기술은 CRISPR Cas13a와 RPA 반응을 함께 사용한 SHERLOCK 기술과 유사한 점이 많습니다.
두 기술 모두 등온 핵산 증폭 기술과 유전자 가위인 CRISPR Cas를 함께 사용한 기술입니다.
등온 핵산 증폭 기술 (RPA or LAMP)를 활용하여 표적 핵산을 기하급수적으로 증폭시킨 후 CRISPR Cas 시스템이 그를 인식하여 신호를 내는 방식으로 둘 다 매우 효율이 높은 기술입니다.
DETECTR 기술은 반응에 반복적인 온도 변화가 필요 없기 때문에 thermal cycler를 요구하지 않아 현장 진단 적용에 활용하기 용이하며 증폭 효율도 매우 좋기 때문에 현재 표준 기술인 PCR을 대체할 수 있는 유망한 기술이라고 생각합니다.