Asymmetric RPA를 활용하여 유전자 가위인 크리스퍼 카스12의 시스템에서 PAM-free한 방식으로 표적 핵산을 검출한 기술에 대해 이야기해 보도록 하겠습니다.
CRISPR Cas12 시스템은 이중 가닥의 DNA를 인식하여 주변의 단일 가닥의 DNA를 비특이적으로 자르는 활성을 통해 진단에 많이 활용되고 있습니다.
그렇기 때문에 증폭 기술의 표준이 되는 polymerase chain reaction (PCR) 기술이나 등온 핵산 증폭 기술 중 널리 활용되는 loop-mediated isothermal amplification (LAMP) 기술 그리고 recombinase polymerase amplification (RPA) 기술과 같이 활용되는데 이유가 세 기술 모두 이중 가닥의 DNA를 증폭 산물로 생성하기 때문입니다.
하지만 CRISPR Cas12 시스템이 이중 가닥의 DNA를 인식하기 위해서는 이중 가닥의 DNA 내에 protospacer adjacent motif (PAM) 염기 서열이 있어야 인식할 수 있다는 단점이 있습니다.
검출하려고 하는 유전자에 PAM 염기 서열이 없다면 검출할 수 없는 한계점이 있습니다.
이러한 문제점을 해결하기 위한 방안으로 CRISPR Cas12 시스템은 단일 가닥의 유전자를 인식할 수 있는 특징을 활용할 수 있습니다.
하지만 위에서 언급했듯 PCR, RPA 그리고 LAMP 같은 기술은 이중 가닥의 DNA를 생성물로 하기 때문에 효율이 좋은 핵산 증폭 기술과 함께 사용할 수 없다는 문제가 있습니다.
본 논문의 저자들은 이를 해결하기 위한 대책을 제시하였고 그에 관련해서는 본문에서 보다 구체적으로 이야기하겠습니다.
1. Asymmetric RPA를 활용한 PAM-free 크리스퍼 카스 기술 서론
저자들이 제안한 기술의 배경지식이 되는 내용을 서론에서 제시하고 있습니다.
먼저, CRISPR Cas12 시스템은 표적 DNA (단일 or 이중 가닥)에 의해 주변의 단일 가닥의 DNA를 비특이적으로 자르는 collateral cleavage 활성에 대해 언급하며 논문의 메인이 되는 CRISPR Cas12 시스템에 대해 설명하고 있습니다.
분자 진단 분야에 활발히 적용되는 CRISPR Cas 시스템은 때때로 민감도 문제가 있어 증폭 기법과 함께 사용된다고 언급하며 이러한 문제를 해결하기 위한 방법으로 등온 핵산 증폭 기술인 LAMP 기술과 RPA 기술에 대해 이야기하였습니다.
그중 RPA 기술과 CRISPR Cas 기술이 함께 활용된 DETECER, HOLMES 기술을 언급하며 논문의 중요한 배경지식인 RPA 기술에 대해 언급하였습니다.
다음으로는 현재 기술이 가진 문제점에 대해 서술하고 있습니다.
기존 크리스퍼 카스 시스템의 표적 핵산 검출 단계는 두 단계로 이루어지며 표적 핵산을 증폭하는 증폭 단계와 CRISPR Cas 시스템이 그를 인식하여 절단하는 단계로 구성되어 있음을 서술했습니다.
이러한 두 단계의 과정은 검출 과정을 복잡하게 하고 실험 중 발생할 수 있는 contamination이 있음을 문제로 제시하였습니다.
이를 극복하기 위해 단일 단계로 CRISPR Cas 시스템과 RPA 기술을 접목한 사례가 있지만 효율이 좋지 않았습니다.
저자들이 추론하는 이유는 crRNA와 PAM 염기 서열에 의한 과도한 CRISPR Cas12 시스템의 활성화가 RPA 핵산 증폭 반응을 억제할 수 있다는 점입니다.
이를 해결하기 위해 asymmetric 기술에 대해 이야기하며 asymmetric RPA 반응에서는 적은 양의 이중 가닥 DNA를 가지고 많은 양의 단일 가닥의 DNA를 생성할 수 있기 때문에 위 문제에 대한 해결책이 될 수 있다고 이야기하였습니다.
2. Asymmetric RPA를 활용한 PAM-free CRISPR/Cas 기술
앞선 배경을 바탕으로 저자들이 제안한 기술의 모식도는 아래와 같습니다.
DOI: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c05545
ang, L., Chen, G., Wu, J., Wei, W., Peng, C., Ding, L., … & Xu, J. (2024).
A PAM-Free One-Step Asymmetric RPA and CRISPR/Cas12b Combined Assay (OAR-CRISPR) for Rapid and Ultrasensitive DNA Detection. Analytical Chemistry, 96(14), 5471-5477.
모식도를 보며 일련의 반응 과정에 대해 설명하도록 하겠습니다.
우선 이중 가닥의 표적 DNA를 RPA 프라이머들이 인식하여 일반적인 symmetric RPA 반응이 진행됩니다.
Symmetric RPA 반응 결과 이중 가닥의 DNA가 생성되게 되며, 이때 적은 양이 들어간 방향의 프라이머는 전부 소진되게 됩니다.
결과적으로 한 방향의 프라이머만 남게 되어 symmetric RPA에 의해 생성된 이중 가닥의 DNA로부터 단일 가닥의 DNA를 많이 생성하는 asymmetric RPA 반응이 진행됩니다.
그 결과 생긴 수많은 단일 가닥의 DNA는 CRISPR Cas12 시스템의 collateral cleavage 활성을 유도하여 주변의 단일 가닥의 DNA를 비특이적으로 자르게 됩니다.
이때 DNA reporter를 사용하게 되는데 DNA reporter는 한쪽 말단에는 형광 물질을 반대쪽 말단에는 quencher를 modification한 짧은 단일 가닥의 DNA입니다.
CRISPR Cas12 시스템의 collateral cleavage에 의해 잘린 DNA reporter는 형광 물질과 quencher 사이의 거리가 멀어져 형광을 발생시키게 됩니다.
저자들은 asymmetric RPA 기술에서 단일 가닥의 DNA가 생성되는 것을 확인하고 더 높은 효율의 조건을 잡기 위해 다양한 프라이머 비율에서 실험을 진행하였습니다.
프라이머 간 비율이 1:1인 [조건 1]부터 비율이 320:1인 [조건 8]의 비율까지 실험을 진행하였습니다.
위 그림의 (A)는 agarose gel 이미지로 DNA가 가지는 전기화학적 특징을 활용한 전기영동 방법으로 주로 정량 및 정성 분석에 활용됩니다.
그림을 보면 비율이 1:1인 경우 심지어 10:1인 경우까지도 거의 단일 가닥의 DNA가 보이지 않는 반면, 160:1 [조건 7]과 320:1 [조건 8]에서는 확실하게 단일 가닥의 DNA가 생성된 것을 이미지로 볼 수 있습니다.
추가적인 입증을 위해 (B)의 실험을 진행하였으며 이는 agarose gel 결과와 동일하게 비율의 차이가 커질수록 선명하게 검출되는 것을 확인할 수 있었습니다.
저자들은 추가적으로 CRISPR Cas 시스템, crRNA의 농도 그리고 반응 온도 최적화까지 실험을 진행하여 기술의 효율을 확보하였으며 그 결과 8분 이내에 60 copies/μL의 성능으로 표적 핵산을 검출하는데 성공하였습니다.