오늘은 asymmetric RPA 기술과 유전자 가위인 크리스퍼 카스12a를 활용하여 표적 핵산을 검출한 논문에 대해 리뷰하려고 합니다.
RPA 기술은 가장 널리 활용되고 있는 등온 핵산 증폭 기술로 증폭 효율이 좋아 30분 이내에 아주 민감하게 표적 핵산을 검출할 수 있는 기술입니다.
RPA 기술을 통해 생성되는 증폭 산물은 이중 가닥의 DNA이며 CRISPR Cas12a는 이중 가닥의 DNA를 인식할 수 있기 때문에 함께 많이 사용되어왔습니다.
하지만 CRISPR Cas12a 시스템은 protospacer adjacent motif (PAM) 염기 서열이 있는 이중 가닥의 DNA를 인식하기 때문에 설계에 자유롭지 못한다는 단점이 있습니다.
오늘 리뷰할 논문에서는 이러한 단점을 극복할 수 있는 방법을 제시하였습니다. 본문에서 함께 알아보도록 하겠습니다.
1. RPA와 유전자 가위 크리스퍼 카스12a 활용 핵산 검출 기술 서론
우선 논문의 저자들이 서론에서 언급한 내용에 대해 알아보겠습니다.
우선 표적 핵산에 대한 서술을 하고 나서 이후 증폭 기술과 유전자 가위 기술에 대한 전반적인 서술을 바탕으로 제안하는 기술이 필요한 이유에 대해 이야기하고 있습니다.
먼저 인간과 동물 그리고 식물 모두 바이러스와 박테리아에 위협을 받고 있음을 이야기하며 예를 들어 결핵을 유발하는 mycobacterium tuberculosis는 인간에게 심각한 위협이 되며 매우 높은 감염력을 가지고 있다고 합니다.
다양한 균에 대한 치료를 위해서 여러 약물이 활용되지만 진단 없이 약물을 남용하거나 경험적 치료로 인해 다제내성 (MDR), 광범위 내성 (XDR), 초 광범위 내성 (XXDR), 완전 내성 (TDR) 균주들이 발생하는 것이 문제라고 합니다.
세계보건기구 (WHO)는 2035년까지 결핵의 유행을 종식시키는 것을 목표로 하고 있다고 언급하며 약물 내성 균주와 야생형 균주를 구분하는 기술이 필요하다고 서술했습니다.
저자들은 다음으로 Lumpy Skin Disease Virus (LSDV)라는 바이러스에 대해 이야기를 꺼냈습니다.
LSDV는 소에 감염을 일으켜 식욕 부진, 고열, 피부 병변 등을 유발한다고 합니다.
또한 높은 발병률과 전염성을 가지고 있다고 말하며 양두병 바이러스 (SPPV)와 염소두병 바이러스 (GTPV)와 97%의 높은 유전적 상동성을 가지고 있어 구별하기 어렵다는 문제를 제기했습니다.
저는 갑자기 결핵 균에 대한 서술을 하다가 LSDV에 대한 서술이 나와 어색한 부분이 있다고 생각했습니다.
그러나 뒤에 서술에서 이러한 상동성이 높은 LSDV를 민감하게 검출하는 것을 모델로 결핵을 해결할 수 있음을 저자들은 이야기하고 있습니다.
이러한 상동성이 높은 염기 서열을 구분하기 위해서는 sequencing 기술과 polymerase chain reaction (PCR) 기술이 활용되고 있으나 시간이 많이 소요되고 전문 인력을 필요로 한다는 단점이 있습니다.
이를 극복하기 위해 새로운 기술 개발이 필요하다고 서술하였습니다.
또한, 유전자 가위인 CRISPR Cas 시스템에 대해 이야기하고 있으며 그 원리에 대해 설명하고 있습니다.
저는 이를 본문에서 구체적으로 다루도록 하겠습니다.
2. Asymmetric RPA 기술과 CRISPR Cas12를 활용한 핵산 검출 기술
저자들은 서론에서 기존 sequencing 기술과 PCR 기술에 대한 문제점을 제시하며 새로운 기술 개발이 필요하다고 말했습니다.
이를 대체할 수 있는 기술로 등온 핵산 증폭 기술 중 하나인 RPA 기술을 활용하였습니다.
이후 CRISPR Cas12a 시스템과 함께 활용하려고 하였으며 제안한 기술 모식도를 보기에 앞서 CRISPR Cas12a에 대해 간략한 설명을 하겠습니다.
CRISPR Cas12a는 crispr RNA (crRNA)가 이중 가닥의 DNA나 단일 가닥의 DNA를 인식하면 trans cleavage 활성에 의해 주변에 있는 단일 가닥의 DNA를 비특이적으로 절단하게 됩니다.
이러한 특성을 바탕으로 CRISPR Cas12a는 진단 기술에 다양하게 활용되고 있으며 특히 loop mediated isothermal amplification (LAMP) 기술과 위에서 언급한 RPA 기술이 함께 활용되고 있습니다.
그러나, CRISPR Cas12a 시스템은 이중 가닥의 DNA를 인식하기 위해서는 protospacer adjacent motif (PAM) 염기 서열이 이중 가닥에 포함되어야 합니다.
이러한 문제로 검출하려고 하는 염기 서열에 PAM 염기 서열이 없다면 검출할 수 없는 문제가 있습니다.
하지만 CRISPR Cas12a는 단일 가닥의 DNA를 인식할 때는 PAM 염기 서열이 필요하지 않은 점에 초점을 맞춰 저자들은 기술을 설계한 것 같습니다.
Asymmetric RPA 기술은 기존 RPA 기술과 다르게 한쪽의 프라이머는 적은 양을 넣고 반대쪽의 프라이머는 과량을 넣어 한쪽으로만 반응을 활발하게 진행하도록 하는 기술로 결과적으로 많은 양의 프라이머를 넣은 쪽에 해당하는 단일 가닥의 DNA가 많이 생성되게 하는 기술입니다.
저자들이 제안한 기술의 검출 모식도를 보기 전에 핵심 요소 기술인 RPA 기술과 CRISPR Cas12a 기술에 대해 구체적 내용이 궁금하신 분들은 아래 글을 보면 좋을 것 같습니다.
저자들이 제안한 기술의 검출 모식도는 아래와 같습니다.
DOI: https://doi.org/10.1021/acssensors.3c01686
Cao, G., Yang, N., Xiong, Y., Shi, M., Wang, L., Nie, F., … & Hou, C. (2023).
Completely Free from PAM Limitations: Asymmetric RPA with CRISPR/Cas12a for Nucleic Acid Assays. ACS sensors, 8(12), 4655-4663.
모식도를 보면 (A)의 경우 PAM 염기 서열이 있을 때는 Asy-RPA를 진행하였을 때 PAM 염기 서열이 있는 것과 없는 것 모두 신호가 잘 발생하는 것을 확인할 수 있었습니다.
이는 (C)에서 Sym-RPA를 진행하였을 때는 신호가 전혀 발생하지 않음을 극복한 사례라고 저자들은 이야기하고 있습니다.
(b)를 보면 Asy-RPA와 Cas12a가 PAM 염기 서열 없이 유전자에 기반하여 Mutant type과 wide type을 구별할 수 있음을 보여줬습니다.
물론 저자들도 Sym-RPA의 경우에는 양쪽 프라이머가 적절한 양이 있어 지수함수적으로 반응이 진행되지만 Asy-RPA의 경우 초반에는 양방향으로 반응이 진행되지만 소량 넣어준 쪽의 프라이머가 모두 소진되면 그때부터는 선형적으로 증폭이 진행되는 단점이 있어 반응 효율이 좋지 않다고 이야기하였습니다.
하지만, Asy-RPA를 활용하여 PAM이 없어도 CRISPR Cas12a 시스템을 활용할 수 있다는 점이 본 기술에서 주장하는 장점이라고 생각합니다.