오늘은 3D nanoplasmonic 기반 EGFR (epidermal growth factor receptor) 돌연변이 검출 논문에 대해 리뷰 하겠습니다.
EGFR은 폐암에서 중요한 biomarker로 이용되는데 이를 금나노 입자를 이용한 금 나노기둥이 배열된 3D plasmonic 나노구조를 통해 검출한 기술입니다.
검출을 위해 등온 핵산 증폭 기술 중 하나인 recombinase polymerase amplification (RPA) 방식을 활용하였습니다.
제안된 기술은 일반적인 reaction tube에서 반응을 진행한 것이 아닌 멀티플렉스 분석 칩을 만들어 EGFR mutation을 성공적으로 검출해냈습니다.
이후 논문의 서론, 본론 내용을 바탕으로 유전적 돌연변이의 고감도 멀티플렉스 검출 기술에 대해 구체적으로 알아보겠습니다.
1. 논문 Introduction
논문에서는 표적 물질에 대해 서술하면서 introduction을 시작하였습니다.
한글로 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)은 폐암의 중요한 바이오마커로 활용됩니다.
환자로부터 다양한 돌연변이가 발견되며 Exon 19 deletion, Exon 21 point mutation, Exon 20 insertions이 있습니다.
폐암의 생존율은 1기에서 4기까지 진행됨에 따라 급격하게 생존율이 감소하기 때문에 조기 진단과 치료가 중요함을 서술하였습니다.
이에 따라 EGFR 돌연변이의 민감하고 특이적인 검출 기술이 중요하다고 하였습니다.
다음으로 액체생검 (liquid biopsy)는 조직 검사의 대안이 되는 기술로 혈액 내의 circulating tumor DNA (ctDNA)를 검출하는 기술입니다.
NGS (next generation sequencing) 기술이 유전체 연구에서 중요하게 활용되지만 민감도 문제, 긴 처리 시간, 가격, 다양한 장비의 필요성 때문에 어려움이 있다고 하였습니다.
그리고 PCR (polymerase chain reaction)의 경우 real time PCR과 droplet 기반 digital PCR 방법이 대안이 될 수 있지만 낮은 민감도와 다양한 mutation을 보는데 어려움이 있다고 했습니다.
또한, 저자들은 금 나노입자를 바탕으로 3D plasmonic 나노 구조를 통해 EGFR 돌연변이를 검출하고자 했습니다.
3D nano plasmonic structure는 3D 공간 내에서 빛과 물질 간의 상호작용이 강화되어 표면에서 20-30 nm 거리에서 강력한 PEF 효과를 나타내는 것에 대해 언급했습니다.
이러한 배경을 가지고 저자들은 3D-nano plasmonic 마이크로 array을 통해 돌연변이 DNA를 검출하는 분석칩을 개발하였으며 그 원리에 대해서는 본문 내용에서 설명하도록 하겠습니다.
2. 3D nanoplasmonic 기반 RPA 기술을 활용한 검출 기술
DOI: https://doi.org/10.1002/smsc.202400101
Lee, J. Y., Jeong, B. H., Jung, H. S., Kang, T., Park, Y., Rho, J. K., … & Lee, M. Y. (2024). Highly Sensitive 3D‐Nanoplasmonic‐Based Epidermal Growth Factor Receptor Mutation Multiplex Assay Chip for Liquid Biopsy. Small Science, 2400101.
본 기술은 EGFR mutation 중 Exon 19 deletion, Exon 20 insertion 그리고 Exon 21 point mutation을 표적 유전자 돌연변이로 선정하여 검출하였습니다.
저자들은 mutation과 wild type 모두 증폭 가능한 recombinase polymerase amplification (RPA) primer를 설계하였습니다.
Reverse primer의 5’ 말단은 인산화되어 있어 추후 반응에 활용될 수 있게 설계하였으며 wild type inhibitor는 3’ 말단에 quencher를 달았습니다.
또한, fluorescent probe에는 3’ 말단에 형광 물질인 cyanine dye (Cy5)를 달아 추후 형광을 발생하게 하였으며 capture probe는 5’ 말단에 biotin을 표지하여 고정하였습니다.
오늘은 논문의 핵심 기술을 중점적으로 설명할 예정이므로 RPA 반응이 궁금하신 분들은 아래 글을 참고하면 됩니다.
이제 primer와 probe에 대해 설명하였으므로 검출 반응에 대해 설명하도록 하겠습니다.
반응은 39에서 30분 동안 멀티플렉스 RPA 반응을 진행합니다.
RPA 반응 결과 mutation의 유무와 상관없이 모두 이중 가닥의 DNA가 생성되게 됩니다.
생성된 이중 가닥의 DNA는 한쪽 3’ 말단이 인산화되어 있어 람다 exonuclease에 의해 모두 제거됩니다.
(람다 exonuclease는 인산화된 3’ 말단을 시작으로 DNA를 제거하는 효소입니다.)
결과적으로 단일 가닥의 DNA들이 남게 되며 그것들은 3D nanoplasmonic chip에 미리 고정해놓은 capture probe에 상보적으로 결합하게 됩니다.
이때 돌연변이로부터 생성된 단일 가닥의 DNA는 PEF 효과로 인해 높은 형광 신호를 발생하게 되지만, wild type으로부터 생성된 단일 가닥의 DNA는 wide type inhibitor에 의해 형광 신호가 억제되어 형광 신호가 발생하지 않습니다.
이러한 원리를 통해 EGFR의 mutation을 멀티플렉싱 방식으로 성공적으로 검출하였습니다.
저자들은 다양한 요소에 대해 최적화를 진행하여 매우 민감하게 표적 mutation을 검출하였으며, 특히 PEF effect를 크게 하기 위해 최적의 RPA 생성물의 길이를 조절한 실험이 효율을 크게 높여줬다고 생각합니다.
3. 리뷰를 마치며
오늘은 금입자를 통해 만들어진 3D nanoplasmonic micro assay에서 등온 핵산 증폭인 RPA 기술과 람다 exonuclease를 활용 그리고 적절한 inhibitor를 사용하여 EGFR mutation을 검출한 논문에 대해 알아봤습니다.
본 논문은 다른 기술 대비 훌륭한 민감도와 특이도를 바탕으로 멀티플렉싱 방식으로 검출했다는 것에 의의가 있는 논문입니다.
하지만 추가적인 람다 exonuclease 과정은 반응을 번거롭게 하고 반응 시간이 오래 걸리게 하는 요소로 작용하고 있기에 이 부분을 극복한다면 더 좋은 기술이 될 것이라고 생각합니다.