오늘은 유전자 가위 중 하나인 크리스퍼 카스13 (CRISPR Cas13)에 대해 알아보겠습니다.
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기술은 Cas9, Cas12와 같이 단백질의 유니크한 활성을 활용하여 많이 진단에 활용되고 있습니다.
오늘은 RNA를 특이적으로 인식하여 비특이적으로 주변에 있는 RNA를 절단하는 Cas13 단백질에 대해 소개할 예정입니다.
1. 크리스퍼 카스13(CRISPR Cas13)의 원리
CRISPR Cas13은 CRISPR Cas12와 활성이 유사한 점이 있지만 큰 차이점 또한 있습니다. 차이점이 있습니다.
유사한 점과 차이점 설명에 앞서 CRISPR Cas13의 원리에 대해 설명하겠습니다.
1) 먼저 CRISPR Cas13a와 crRNA가 복합체를 형성합니다.
2) 형성된 CRISPR Cas13a-crRNA 복합체는 crRNA에 상보적으로 결합 가능한 표적 RNA를 인식합니다.
3) 표적을 인식하면 cis cleavage와 trans cleavage가 활성화되는데 cis cleavage 활성으로 인식한 표적 RNA가 절단되게 됩니다.
4) 이후, trans cleavage 활성에 의해 주변의 RNA를 비특이적으로 절단하게 됩니다.
5) 일반적으로 RNA reporter를 사용하여 신호를 발생시키며 RNA reporter는 한쪽에는 형광 물질을 표지하고 반대쪽에는 quencher를 표지하여 잘리기 전에는 형광물질과 quencher 사이의 거리가 가까워서 형광이 quenching되어 있었지만, 잘린 후에는 둘 사이의 거리가 멀어져 형광이 발생하게 됩니다.
2. 크리스퍼 카스13과 카스12의 비교
다음으로 CRISPR Cas12와 CRISPR Cas13 시스템의 유사점과 차이점에 대해 알아보겠습니다.
유사점
1) Cas12와 Cas13 모두 crispr RNA (crRNA)와 함께 복합체를 형성합니다.
※ 물론 crRNA의 표적 핵산을 인식하는 염기서열 말고도 crRNA를 구성하는 염기서열에는 차이가 있습니다.
2) 두 가지 cleavage 활성을 가지고 있습니다. 인식한 표적 핵산을 절단하는 cis cleavage activity와 주변의 핵산을 비특이적으로 절단하는 trans cleavage activity를 보입니다.
3) 둘 다 이러한 유니크한 활성을 바탕으로 진단 및 치료에 활발히 활용되고 있으며 핵산 증폭 기술과 함께 사용되면 높은 특이도와 민감도를 보입니다.
차이점
1) Cas12와 Cas13의 가장 큰 차이점은 Cas12의 경우 단일 가닥의 DNA나 이중 가닥의 DNA를 인식하지만 Cas13의 경우 단일 가닥의 RNA를 인식합니다.
2) 인식하는 핵산의 종류가 다른 것뿐 아니라, trans cleavage 활성에 의해 절단되는 핵산 또한 Cas12의 경우 주변의 단일 가닥 DNA를 Cas13의 경우 주변의 단일 가닥 RNA를 비특이적으로 절단하게 됩니다.
※ 앞선 설명들에서 단일 가닥의 RNA라 표현하지 않고 RNA라고 서술한 이유는 대부분의 RNA는 단일 가닥으로 존재하기 때문입니다.
3) 함께 활용되는 등온 핵산 증폭 기술로는 LAMP (loop-mediated isothermal amplification) 기술과 RPA (recombinase polymerase amplification) 기술이 이중 가닥의 DNA를 반응 생성물로 하기 때문에 Cas12a와 함께 사용되며, NASBA (nucleic acid sequence-based amplification) 기술과 in vitro transcription 기반 기술이 RNA를 반응 생성물로 하기 때문에 Cas13a와 함께 활용됩니다.
※ 물론 LAMP 기술과 RPA 기술 역시 생성된 이중 가닥으로부터 추가적인 transcription 반응을 설계하여 RNA를 생성할 수 있긴 하지만 비효율적이라고 생각합니다.
위에 설명한 LAMP, RPA, NASBA 기술에 대해 궁금하신 분들은 아래 글을 참고해주시기 바랍니다.