크리스퍼 카스를 활용한 표적 핵산의 전기화학적 검출 관련 논문에 대해 리뷰하도록 하겠습니다.
유전자 가위인 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기술은 분자 진단 분야에 널리 활용되고 있습니다.
연관 단백질인 Cas 단백질과 함께 사용되며 대표적으로 Cas9, Cas12, Cas13 그리고 최근에는 새롭게 engineering 된 Cas 단백질이 사용되어 핵산 검출의 효율을 높이고 있습니다.
분자진단 기술의 최종적인 신호를 내는 방법은 다양하게 있지만 일반적으로 널리 활용되는 분자 진단 기술인 polymerase chain reaction (PCR) 기술은 대부분 형광 신호를 통한 최종 결과를 확인하게 됩니다.
비색 검출 반응 및 전기화학적 검출 방법 또한 널리 활용되고 있습니다.
오늘은 이러한 CRISPR Cas 시스템을 통해 전기화학적으로 표적 핵산을 검출한 기술에 대해 설명하도록 하겠습니다.
1. Electrochemical detection based on CRISPR Cas system 서론
저는 앞서 오늘 리뷰할 논문에 대한 간략한 설명과 배경을 이야기하였습니다.
이제는 논문에서 저자들이 작성한 서론에서 그 배경과 필요성에 대해 알아보겠습니다.
저자들은 질병 바이오마커를 정확하고 빠르며 cost-effective 하게 현장에서 진단하는 기술을 개발하는 것이 매우 중요하며 이러한 개발이 결국 개인 맞춤형 의학으로 이어지고 인간의 건강에 큰 이득을 줄 수 있다고 이야기하며 서론을 시작하였습니다.
그중에서 전기화학 신호 기반 센서에 대해 빠른 신호 출력 성능을 가지고 있으며 비교적 저렴하고 간단하다고 이야기하고 있습니다.
센서에 있어 중요한 것은 정확성이라고 말하며 최근 유전자 가위인 CRISPR Cas 시스템이 표적 핵산을 정확하게 절단하는 성능을 이야기하며 다양한 Cas 단백질을 활용하여 비특이적인 절단 (trans cleavage 활성)을 통해 형광 신호를 내는 시스템에 대해 이야기하였습니다.
저자들은 이러한 배경에서 CRISPR Cas12의 비특이적인 절단을 활용하여 비용 효율적이고 휴대 가능한 전기화학적 바이오 센싱 시스템으로 확장하고자 하였습니다.
금 기반의 three-electrode 일회용 센서가 개발에 활용되었으며 CRISPR Cas 시스템의 표적 핵산과 crispr RNA (crRNA) 간의 상보적인 결합 특징과 표적 핵산의 protospacer adjacent motif (PAM) 서열에 기반하여 표적 핵산 가닥을 인식하고 절단하도록 설계하였습니다.
CRISPR Cas system의 검출 신호를 전기화학적으로 검출하기 위해서는 전기화학적 신호를 낼 수 있는 단일 가닥의 DNA reporter를 설계해야 했고 저자들은 methylene blue라는 물질을 DNA reporter에 modification 하였습니다.
또한 전기적인 신호를 얻기 위해 센서 표면 (electrode 표면)에 그것을 고정해야 했으며 일반적으로 금 표면에 핵산을 고정할 때 사용되는 thiol기를 수식하여 그것을 고정하였습니다. 이후에는 서론의 마지막에 저자들은 본 기술에 대해 간략하게 설명하고 있지만 저는 이를 본론에서 모식도를 보고 설명하도록 하겠습니다.
2. 크리스퍼 카스 시스템을 기반으로 한 전기화학적 검출
전기화학적으로 크리스퍼 카스 시스템 활용하여 표적 핵산을 검출한 기술의 모식도는 아래와 같습니다.
DOI: https://doi.org/10.1002/anie.201910772
Dai, Y., Somoza, R. A., Wang, L., Welter, J. F., Li, Y., Caplan, A. I., & Liu, C. C. (2019).
Exploring the trans‐cleavage activity of CRISPR‐Cas12a (cpf1) for the development of a universal electrochemical biosensor. Angewandte Chemie, 131(48), 17560-17566.
모식도의 A 부분을 먼저 보면 표적 핵산 (target)이 crRNA에 결합한 것을 볼 수 있습니다.
서론에서 언급한 것처럼 표적 핵산에는 PAM 염기 서열이 있는 것을 확인할 수 있습니다.
이후 CRISPR Cas12 system이 활성화되며 cis cleavage에 의해 표적 핵산이 절단되고 이후 trans cleavage에 의해 주변의 DNA reporter를 비특이적으로 자르게 됩니다.
다음으로 모식도의 B를 보면 금 전극에 메틸렌블루 (MB)가 고정되어 있는 것을 확인할 수 있습니다.
모식도의 C는 표적 핵산이 CRISPR Cas12 시스템의 trans cleavage를 활성화시켜 고정되어 있던 DNA reporter가 잘리게 되고 메틸렌블루가 전극의 표면으로부터 멀어지게 됩니다.
이에 따라 전기화학적 신호를 전극이 받아들이게 했던 MB가 멀어져 모식도 E를 보면 전기화학적 신호가 with target (표적 핵산이 있을 경우)일 때 감소하는 것을 볼 수 있습니다.
반면에, 표적 핵산이 없는 경우에는 crRNA가 인식할 표적 핵산이 존재하지 않아 CRISPR Cas12의 trans cleavage가 활성화되지 않고 메틸렌블루를 가지고 있는 DNA reporter 또한 절단되지 않아 그대로 높은 전기화학적 신호가 나는 것을 확인할 수 있습니다.
저자들은 제안한 방식의 검출 효율을 높이고자 다양한 최적화 실험을 진행하였습니다.
여러 종류의 CRISPR Cas12를 사용하기도 하고 trans cleavage 시간 최적화, 마그네슘 농도 최적화 DNA reporter의 길이 최적화 등 다양한 실험을 진행하여 기술의 효율을 확보하였습니다. 그 결과 매우 민감하고 특이적으로 표적 핵산을 성공적으로 검출하여 세계적으로 권위 있는 출판사인 Angewandte Chemistry에 출판되었습니다.