유전자 가위 크리스퍼 카스13 기술은 표적 핵산을 인식했을 때 주변의 단일 가닥의 RNA를 비특이적으로 절단하는 활성을 이용하여 진단에 활용되고 있습니다.
특히, PCR뿐만 아니라 등온 핵산 증폭 기술과 함께 활용하여 보다 높은 민감도와 특이도를 확보할 수 있는 기술입니다.
우선, CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Cas13의 원리에 대해 간단히 설명한 후 진단 예시를 들어 이해를 돕도록 하겠습니다.
1. 핵산 진단에 활용되는 크리스퍼 카스13의 원리
감염성 바이러스와 같은 표적 핵산을 검출하기 위해 CRISPR Cas13이 진단에 활용되는 원리에 대해 간략히 설명하도록 하겠습니다.
오늘 글은 CRISPR Cas13의 진단에서의 활용에 집중하여 서술할 예정이므로 관련 구체적인 원리는 아래 글을 참고하시면 자세히 정리되어 있습니다.
먼저 CRISPR Cas13a와 crispr RNA (crRNA)가 복합체를 형성합니다.
이후, 형성된 CRISPR Cas13a-crRNA 복합체는 crRNA가 상보적으로 결합 가능한 표적 RNA를 인식합니다.
이후, 인식한 표적 핵산을 자르는 활성과 주변의 RNA를 비특이적으로 절단하는 활성을 나타내게 됩니다.
주변에 있는 RNA reporter를 비특이적으로 절단하게 되어 lateral flow assay (LFA) 방식이나 형광 방식으로 신호를 얻을 수 있게 됩니다.
여기서 RNA reporter는 짧은 단일 가닥의 RNA의 양 끝에 특정 물질을 표지한 RNA입니다.
형광 신호를 얻을 때 활용하는 RNA reporter는 한쪽 말단에는 형광을 반대쪽에는 quencher를 표지하여 활용하게 되며 비특이적으로 잘리기 전에는 형광 물질과 quencher 사이의 거리가 가깝기 때문에 형광이 발생하지 않지만 절단되어 멀어지면 형광이 발생하는 원리입니다.
다음으로 LFA 방식 (대표적으로 널리 활용되는 예시로 자가 진단키트가 있음)에 활용되는 RNA reporter는 한쪽 말단에는 형광 물질 (FAM) 반대쪽에는 biotin을 표지하여 활용하게 됩니다.
정확한 원리를 이해하기 위해서는 LFA 방식에 대한 공부가 필요하지만 간략하게 설명하자면, LFA 방식은 LFA strip 상에 반응 용액을 흘려 준 후 생성되는 밴드를 확인하는 방법입니다.
LFA strip은 반응 용액을 넣어주는 부분과 용액안의 FAM에 붙을 수 있는 gold-anti FAM antibody가 있으며 용액이 흘러 지나가는 control line (biotin이 붙을 수 있음) 그리고 test line (gold-anti FAM antibody가 붙을 수 있음)으로 구성되어 있습니다.
우선 negative 반응의 경우 RNA reporter가 잘리지 않았기 때문에 모든 RNA reporter는 두 말단에 FAM과 biotin을 모두 가지고 있기 때문에 test line까지 흘러가지 못하고 모두 control line에 결합하게 됩니다.
그러나 positive 반응의 경우 RNA reporter가 절단되기 때문에 잘려서 biotin만 가진 부분은 control line에 결합하게 되고 절단 이후 FAM만 가지는 부분은 흘러가서 test line에 결합하게 되어 밴드를 나타내게 됩니다.
2. CRISPR Cas13a 시스템이 진단에 활용된 예시
CRISPR Cas13 시스템은 특이적으로 표적 핵산을 인식한 후 주변에 있는 RNA reporter를 절단하여 신호를 증폭하는 특징이 있습니다.
주변의 RNA reporter를 잘라내어 신호를 증폭하지만 crRNA가 인식하는 핵산의 수는 증폭이 되지 않기 때문에 인식할 수 있는 핵산의 수를 늘릴 수 있는 증폭 기술과 함께 활용되고 있습니다.
DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-020-00603-x
Patchsung, M., Jantarug, K., Pattama, A., Aphicho, K., Suraritdechachai, S., Meesawat, P., … & Uttamapinant, C. (2020).
Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA. Nat Biomed Eng 4: 1140–1149.
위의 예시는 CRISPR Cas13a와 함께 사용한 등온 증폭 기술로 RPA 기술을 활용하였습니다.
본 글에서는 RPA 기술에 대해서는 구체적으로 설명하지 않을 것이기 때문에 RPA 기술이 궁금하신 분들은 아래 글을 참고하면 됩니다.
먼저 표적 핵산을 인식하여 RPA 반응을 진행하게 됩니다.
위 논문의 예시에서는 표적 핵산이 RNA이기 때문에 일반적인 RPA가 아닌 reverse transcription이 함께 진행되는 RT-RPA 기술을 활용하였습니다.
RPA 반응의 결과로 수많은 이중 가닥의 DNA가 생성되게 됩니다.
CRISPR Cas13a 시스템은 이중 가닥의 DNA가 아닌 RNA를 인식하기 때문에 추가적으로 T7 transcription 반응을 진행하여 수많은 RNA를 생성하게 되고 생성된 RNA를 CRISPR Cas13a 시스템이 인식하여 주변에 있는 RNA reporter를 자르게 됩니다.
위의 진단에 활용되는 CRISPR Cas13의 원리에서 설명한 것처럼 반응의 결과를 형광과 LFA 방식으로 확인하게 되어 진단에 활용되는 것을 확인할 수 있습니다.