오늘 리뷰할 논문은 Exponential amplification reaction (EXPAR) 기술과 Exonuclease III 활성을 이용하여 miRNA를 검출한 논문입니다.
EXPAR 기술은 nicking enzyme과 DNA polymerase를 활용하여 짧은 단일 가닥의 DNA를 많이 생성할 수 있는 기술로 증폭 효율이 매우 좋은 기술입니다.
대표적인 등온 핵산 증폭 기술인 loop-mediated isothermal amplification (LAMP), recombinase polymerase reaction (RPA)와 비교하였을 때 기술 설계가 쉽다는 장점이 있습니다.
그러나, 표적 핵산이 길 경우 EXPAR 반응으로 검출하는데 어려움이 있지만 miRNA와 같이 18-24 base 길이의 핵산은 EXPAR 기술로 검출하기 매우 용이하며 오히려 LAMP나 RPA 같은 기술로는 miRNA를 검출하기에 어려움이 있습니다.
1. 논문 서론 (Paper Introduction)
앞서 언급한 대로 논문에서는 표적 핵산인 miRNA에 대해 설명하면서 논문의 서론을 시작하였습니다.
miRNA는 짧은 길이의 RNA로 유전자 발현을 조절하는데 매우 중요한 역할을 합니다.
특히 mRNA를 절단하거나 translation 억제를 하는 역할을 수행합니다.
많은 연구가 진행됨에 따라 miRNA가 암과 관련이 있어 biomarker로 가치가 있음이 알려지게 되었습니다.
예를 들면 miRNA-155는 간세포암의 새로운 biomarker로 환자의 암의 진행을 모니터링하거나 진단할 수 있습니다.
하지만, miRNA는 염기 서열 유사도가 매우 높고 길이가 짧고 양이 매우 적기 때문에 검출하는데 어려움이 있습니다.
그렇기 때문에 핵산 증폭 기술이 필수적이며 현재 표준으로 사용하는 기술은 polymerase chain reaction (PCR) 기술입니다.
하지만 PCR 기술은 시간이 오래 걸리면 비교적 비싸고 큰 기기를 필요로 하는 문제점이 있으며, 제가 실험했을 때 다른 genomic RNA를 검출할 때에 비해 miRNA를 검출할 때 보다 복잡한 protocol을 요구하고 민감도 역시 genomic RNA와 비교했을 때 매우 좋지 않았습니다.
논문에서도 PCR 기술보다 등온 핵산 증폭 기술이 최근에 개발되었다고 이야기하며 rolling circle amplification (RCA) 기술이나 catalytic hairpin assembly (CHA) 기술 그리고 EXPAR 기술에 대해 말했습니다. 그중 EXPAR 기술은 증폭 효율이 좋고 빠르며 민감도가 높다고 말하여 기술을 사용한 근거를 제시했습니다.
다음으로, exonuclease III (Exo III)에 대해 설명하였습니다. Exo III의 경우 매우 훌륭한 활성을 가지고 있으며 표적 핵산 서열과 무관하게 이중 가닥 DNA의 3’-OH 부분을 순차적으로 제거하는 특징에 대해 설명하였습니다. 이제 이러한 introduction 내용을 기반으로 실험 모식도를 보며 추가 설명을 하겠습니다.
2. Exonuclease와 EXPAR 기술을 miRNA 검출
저자들이 제안한 기술의 검출 모식도는 아래와 같습니다.
DOI: https://doi.org/10.1186/s40543-024-00454-0
Wu, X., Zou, S., & Dai, J. (2024). Exonuclease III assisted exponential amplification reaction (EXPAR) for specific miRNA-155 analysis during post-anesthetic nursing. Journal of Analytical Science and Technology, 15(1), 40.
위 그림을 보며 전체적인 검출 순서에 대한 설명을 하겠습니다.
먼저 표적 핵산이 있을 경우, LT probe의 1 부분에 상보적으로 표적 miRNA가 결합하게 되고 Exo III 활성에 의해 1 부분부터 2 부분까지 제거됩니다.
1부분과 2부분이 없어진 LT는 EXPAR template (TS)로 사용되고 표적 miRNA는 또 다른 LT probe에 결합하여 반응을 진행합니다.
다음으로 TS에 primer가 결합하게 되고 이후 DNA polymerase에 의해 DNA가 합성됩니다.
합성된 이중 가닥의 DNA에서 노란색 부분 (5와 6)이 nicking enzyme이 인식할 수 있는 부분으로 6 부분이 절단됩니다.
이후 4번 부분부터 DNA polymerase가 또 DNA를 합성하게 되고 결합해 있던 4*이 strand displacement에 의해 떨어져 나가게 됩니다.
Nicking enzyme과 DNA polymerase의 반복적인 cycle 덕분에 많은 양의 4*가 생성되고 그것은 SP에 결합하여 SP의 8 부분을 자유롭게 만들어줍니다.
SP의 8 부분은 peroxidase mimicking DNAzyme인 G quadruplex이기 때문에 hemin과 결합하여 특수한 구조를 이루게 되고 결과적으로 ABTS를 산화시켜 ABTS+로 만들어 신호를 내게 됩니다.
저자들은 반응 효율을 높이기 위해 nicking enzyme, DNA polymerase, Exonuclease III의 농도에 대한 최적화 실험을 진행하였으며 결과적으로 30분의 반응시간에 1 fM의 표적 miRNA를 검출하는 성능을 확보하였습니다.
3. 마치며
오늘 리뷰한 논문은 EXPAR 반응과 exonuclease III를 같이 활용하여 miRNA를 성공적으로 검출한 기술입니다.
다양한 등온 핵산 증폭 기술들이 새로운 enzyme이나 CRISPR Cas system을 함께 활용하여 민감도와 특이도를 확보하거나 반응 시간을 줄이는 등 여러 방식으로 연구되고 있습니다.
본 논문은 짧은 표적 핵산을 검출하기에 유리한 기술인 EXPAR 기술로 miRNA를 표적하였으며 신호를 peroxidase mimicking DNAzyme으로 확인하여 흥미로운 논문이었습니다. Peroxidase mimicking DNAzyme으로 최종 신호를 보는 경우에는 형광뿐만 아니라 비색 그리고 전기화학 신호로도 최종 신호를 확인할 수 있기 때문에 많은 장점이 있습니다.