오늘은 여러 가지 다중 핵산 증폭 기술을 동시에 활용하여 microRNA (miRNA)를 검출한 논문에 대해 리뷰하겠습니다.
등온 핵산 증폭 기술들은 보통 단일로 활용이 많이 되며 차라리 유전자 가위인 CRISPR Cas 시스템과 함께 활용되는 경우가 많습니다.
그러나, 오늘 리뷰할 논문에서는 miRNA 검출을 위해 strand displacement amplification (SDA), exponential amplification reaction (EXPAR), rolling circle amplification (RCA) 기술이 모두 활용되었습니다.
그뿐만 아니라 다양한 원리들이 활용된 기술로 이에 대해 이해하면 등온 핵산 증폭 기술에 대해 더욱 깊은 지식을 얻을 수 있을 것으로 생각됩니다.
본문에서는 각각의 기술들의 원리와 전체 기술 모식도를 보고 논문에서 제안한 방법에 대해 구체적으로 설명하겠습니다.
1. Introduction
본 논문에서는 검출할 표적 핵산에 대해 먼저 설명하고 있습니다. 표적 핵산인 miRNA은 18-25 nucleotide로 구성된 짧은 단일 가닥의 RNA이며 유전자 발현에 관여하기 때문에 다양한 질병 특히 암의 바이오마커로 활용될 수 있는 잠재력이 있음을 강조하고 있습니다.
그렇기 때문에 miRNA 검출에 대한 연구가 활발히 진행되고 있지만 northern blotting 기술은 miRNA 검출에 있어 표준화된 방법이었지만 시간이 많이 걸리는 단점이 있으며, microarray 기술은 많은 양의 miRNA를 검출하기에 용이하지만 사전에 miRNA에 표지를 하거나 프로브를 고정해야 하는 한계점이 있습니다.
다음으로 reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) 반응이 또 다른 표준 기술이지만 miRNA와 같이 짧은 길이의 핵산을 표적하기에 효율이 좋지 않은 문제가 있다고 저자들은 문제를 제시하였습니다.
한편, 최근 enzyme 반응을 기반으로 다양한 등온 핵산 증폭 기술이 개발되었으며 loop mediated isothermal amplification (LAMP), exponential amplification reaction (EXPAR), rolling circle amplification (RCA), strand displacement amplification (SDA) 등의 기술을 예로 들어 설명하였습니다.
그래서 저자들은 SDA 반응과 RCA 반응을 동시에 활용하여 miRNA를 검출하는 기술을 설계하였으며 표적 miRNA로는 다양한 인간 암 조직이나 세포에서 유망한 바이오마커로 활용되는 let-7 miRNA family 중 let-7d를 선정하였습니다.
또한, 일련의 반응을 통해 생성된 긴 단일 가닥의 DNA는 G quadruplex라는 구조를 가지는 염기 서열을 포함하기 때문에 N-methyl mesoporphyrin IX (NMM)이라는 물질과 함께 형광을 크게 증가시킬 수 있어 이를 통해 신호를 확인하였습니다.
2. 다중 핵산 증폭 기반 miRNA 검출 기술
논문에서 저자들이 제안하는 기술은 다음과 같습니다.
DOI: https://doi.org/10.1038/srep35982
Zheng, X., Niu, L., Wei, D., Li, X., & Zhang, S. (2016).
Label-free detection of microRNA based on coupling multiple isothermal amplification techniques. Scientific reports, 6(1), 35982.
저자들은 본 기술을 설명할 때 SDA 방법과 RCA 방법을 활용했다고 하였지만, 제 생각에는 EXPAR 방법이 더욱 중요하게 활용됐다고 생각합니다.
물론 긴 문장으로 풀어 서술하여 EXPAR 방법에 대해 언급하였지만 구체적으로 말을 하지 않았습니다.
이제 모식도를 보며 한 단계씩 원리를 설명하도록 하겠습니다.
먼저 표적 핵산이 들어올 경우 S1 모양의 핵산과 일부분이 상보적으로 결합하게 됩니다.
S1 모양의 핵산은 hairpin이라고 불리며 말 그대로 머리핀 모양의 핵산 구조를 말합니다.
Hairpin 구조는 루프 구조 아래 상보적으로 결합할 수 있는 염기 서열이 있어 stem을 가지고 있습니다.
Stem 부분은 이미 상보적으로 결합하여 있기 때문에 다른 핵산이 와도 쉽게 결합할 수 없지만 루프 부분은 단일 가닥의 DNA이기 때문에 다른 핵산에 의해 쉽게 결합하게 되고 이에 따라 stem 부분도 결합이 풀리게 됩니다.
Stem 부분의 결합이 풀려 노출되면 S2 (밝은 파란색 DNA)가 그 부분에 결합하게 되고 그것은 프라이머 역할을 수행하게 됩니다.
DNA polymerase (Klenow polymerase)에 의해 DNA가 합성되며 이때 target은 떨어져 나가게 되고 그것은 다시 새로운 S1을 열어 반응을 진행하게 됩니다.
이런 식으로 DNA polymerase에 의해 기존 결합하여 있던 핵산이 떨어져 나가 증폭 반응을 진행하는 것을 크게 SDA 반응이라고 할 수 있겠습니다.
[DNA polymerase는 exonuclease 활성이 있는 DNA polymerase와 exonuclease 활성이 없는 DNA polymerase가 있으며, 이렇게 DNA를 떨어져 나가게 하는 DNA polymerase는 exonuclease 활성이 없는 DNA polymerase입니다.]
결과적으로 S2에 의해 생성된 긴 이중 가닥의 DNA가 생성됩니다.
생성된 이중 가닥의 DNA는 중간에 nicking enzyme이 인식할 수 있는 염기 서열을 가지고 있어 그 부분이 절단되게 되고 이후 DNA polymerase 활성에 의해 절단된 이후의 DNA (EXPAR product 1)는 떨어져 나가게 됩니다.
EXPAR product 1은 이후 S5와 결합하여 DNA polymerase에 의해 이중 가닥의 DNA를 생성하게 되고 생성된 이중 가닥의 DNA에도 nicking enzyme이 인식할 수 있는 염기 서열이 있기 때문에 EXPAR 반응이 진행되어 EXPAR product 2를 생성하게 됩니다.
생성된 EXPAR product 2는 미리 넣어두었던 circular template (CT)에 결합하여 프라이머 역할을 하게 되고 RCA 반응에 사용되는 Phi29 polymerase에 의해 긴 단일 가닥의 DNA를 생성하게 됩니다.
RCA 반응에 의해 CT 염기 서열의 상보적인 DNA를 반복적으로 길게 생성하게 됩니다.
생성된 DNA는 g quadruplex를 반복적으로 가지고 있어 NMM 물질과 함께 있을 때 큰 형광을 발생시킵니다.
본 리뷰에서는 저자들이 제안한 기술에 대한 설명에 집중하였기에 EXPAR 반응과 RCA 반응에 대한 설명이 부족합니다.
EXPAR 반응과 RCA 반응에 대해 구체적인 정보를 얻고 싶으시면 아래 글을 보시면 도움이 됩니다.
3. 논문 리뷰를 마무리하며
저자들은 위에 설명한 기술을 바탕으로 다양한 요소에 대해 최적화 실험을 진행하여 증폭 반응의 효율을 향상시켰습니다.
Nicking enzyme과 DNA polymerase의 농도 최적화 및 검출 시간 NMM 농도 등 다양한 요소를 최적화하였으며 그 결과 1.5 x 10-13M의 검출 한계를 보였으며 다른 let-7 miRNA family를 이용하여 특이도 실험한 결과 성공적으로 let-7d를 특이적으로 검출할 수 있음을 입증하였습니다.
오늘 리뷰한 논문은 하나의 등온 핵산 증폭 기술을 활용한 것이 아니라 다양한 등온 핵산 증폭 기술을 함께 활용하여 핵산을 검출할 수 있음을 보이는 논문이었습니다.
물론, 여러 가지 등온 핵산 증폭을 섞기만 하는 것이 검출 효율을 높이는 방향은 아닐 수 있으며 오히려 하나의 등온 증폭 기술을 변형시키는 것이 더 좋을 수도 있습니다.
하지만 이러한 도전적인 연구가 계속되어야 분자 진단 기술 분야에 발전이 있을 것으로 생각됩니다.